Rekombinant soylarda penisilin asilaz üretkenliği ve niteliklerinin yönlendirilmiş evrim ile iyileştirilmesi

Abstract

Penisilin G asilaz, β-laktam antibiyotiklerinin endüstriyel olarak üretiminde kullanılan anahtar bir enzimdir. Penisilin G ve diğer β-laktam antibiyotiklerinin penisilin G asilaz ile hidrolizi sonucunda 6-aminopenisillanik asit (6-APA) oluşmakta ve oluşan 6-APA ise yarı sentetik antibiyotiklerin üretiminde kullanılmaktadır. Endüstride bu amaç için en çok kullanılan Escherichia coli penisilin G asilazı olmasına rağmen, bu enzimin özellikle kataliz reaksiyonlarındaki etkinliği istenilen seviyede değildir. Bu çalışmada, Escherichia coli penisilin G asilazının enzimatik aktivitesini artırmak amacıyla, hataya eğilimli polimeraz zincir reaksiyonunun birbirini izleyen turları Escherichia coli pac genine uygulandı. Arka arkaya yapılan iki tur hataya eğilimli polimeraz zincir reaksiyonunun ardından, artmış enzim aktivitesine sahip en iyi mutant olan M2234 seçildi ve analiz edildi. M2234'ün yapılan DNA dizi analizi sonucunda, aktif merkezden uzakta yer alan 297'inci amino asit rezidüsünün lizinden izolösine değiştiği görüldü (K297I). Yapılan nitelendirme çalışmalarının ardından, mutant enzimin yaban tip enzime göre 4 kat fazla spesifik aktiviteye sahip olduğu ve ayrıca pH 10'da daha yüksek kararlılık sergilediği görüldü. Bu çalışma güncel bilgiler ışığında değerlendirildiğinde, E. coli pac geni mutantlarının oluşturulmasında hataya eğilimli PCR yönteminin kullanıldığı ilk çalışma olma özelliğini taşımaktadır.

Penicillin G acylase is the key enzyme used in the industrial production of β-lactam antibiotics. This enzyme hydrolyzes penicillin G and other β-lactam antibiotics releasing 6-aminopenicillanic acid (6-APA), which used in the production of semisynthetic antibiotics. Although Escherichia coli penicillin G acylase is most commonly used in industry for this purpose, this enzyme is not good enough for catalysis reactions. In this work, to improve the enzymatic activity of Escherichia coli penicillin G acylase, sequential rounds of error-prone polymerase chain reaction were applied to the Escherichia coli pac gene. After two rounds of error-prone polymerase chain reaction, the best mutant M2234 with enhanced activity was selected and analyzed. DNA sequence analyses of M2234 revealed that one amino acid residue (K297I), located far from the center of the catalytic pocket, was changed. This mutant (M2234) has a specific activity 4.0 times higher than the parent enzyme and also displayed higher stability at pH 10. To our knowledge, there was no report in which the error-prone PCR method was used to improve the properties of penicillin acylase.