Kinetic characterization of Geobacillus kaustophilus ATP-dependent lon protease

Abstract

Prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde, hücre içi dengenin korunması için yanlış katlanmış ya da hasarlı proteinlerin yıkımı büyük önem teşkil etmektedir. Tüm organizmalarda bu rolü ATP-bağımlı proteazlar üstlenmektir. Lon hemen hemen tüm canlı organizmalarda bulunan yegâne ATP-bağımlı proteazdır. Lon'un hücre içindeki birçok fonksiyonu açıklanmış olmasına rağmen, enzimin mekanizması ile ilgili hala cevaplanması gereken önemli sorular bulunmaktadır. Bu amaçla termofilik bir bakteri olan Geobacillus kaustophilus'tan elde edilen Lon (GkLON) ile yapılacak çalışmalar, enzimin mekanizmasını aydınlatmak açısından önemlidir. Bu tez çalışmasında, laboratuvarımızda daha önce E. coli BL21 (DE3) hücrelerine klonlanan GkLON kısmi olarak biyokimyasal, kinetik ve yapısal özellikleri bakımından karakterize edilmiştir. GkLON'un bir kimotripsin benzeri serin proteaz substratı olan Glt-Ala-Ala-Phe-MNA'ya karşı kinetik parametreleri KM ve Vmax sırasıyla 0.6 mM ve 134 mM/min olarak belirlenmiştir. GkLON'un biyokimyasal karakterizasyonu, substrat olarak α-kazein kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Enzimin proteaz aktivitesi ATP varlığında önemli ölçüde artmıştır. Bununla birlikte GkLON, α-caseini CTP ve GTP varlığında daha etkin şekilde yıkıma uğratmıştır. GkLON' un enzimatik aktivitesinin kesin olarak iki değerlikli katyon mevcudiyetine bağlı olduğu belirlenmiştir: en yüksek aktivite Mg2+ varlığında gerçekleşirken Mn2+, Ca2+ ve Co2+ gibi katyonlar da protein yıkımını arttırmıştır. Enzim maksimum aktiviteyi 55oC'de ATP varlığında gerçekleştirmiştir. Bir saat inkübasyon sonunda α-casein yıkımı 55oC'da %62, 37oC'da ise %25 olarak belirlenmiştir. Ayrıca homoloji modellemesine göre Bacillus subtilis ile Geobacillus kaustophilus Lon proteazları arasında %78 oranında dizi benzerliği tespit edilmiştir.

In prokaryotic and eukaryotic cells, the degradation of misfolded or damaged proteins is of great importance for the maintenance of homeostasis. In all organisms, this role is accomplished by ATP-dependent proteases. Lon is the only ATP-dependent protease found in almost all living organisms. Although many functions of Lon in the cell have been explained, there are still important questions to be answered regarding the mechanism of the enzyme. For this purpose, studies with Lon (GkLON) obtained from a thermophilic bacterium Geobacillus kaustophilus are important. In this thesis, in our laboratory previously cloned GkLON in E. coli BL21 (DE3) cells was partially characterized in terms of its biochemical, kinetic, and structural properties. The kinetic parameters KM and Vmax of GkLON against Glt-Ala-Ala-Phe-MNA, a chymotrypsin-like serine protease substrate, were determined as 0.6 mM and 134 mM/min, respectively. Biochemical characterization of GkLON was performed using α-casein as substrate. The protease activity of GkLON was significantly increased in the presence of ATP. GkLON degraded α-casein more efficiently in the presence of CTP and GTP. The enzymatic activity of GkLON was determined to be strictly dependent on the presence of the divalent cation: the highest activity observed in the presence of Mg2+, while cations Mn2+, Ca2+ and Co2+ increased protein degradation. The enzyme achieved its maximum activity at 55oC in the presence of ATP. After one hour of incubation, α-casein degradation was determined as 62% at 55oC and 25% at 37oC. In addition, according to homology modeling, 78% sequence similarity was detected between Bacillus subtilis and Geobacillus kaustophilus Lon.