Effect of oxytetracycline on biogas production and microbial communities during anaerobic digestion of cow manure by fluorescence in situ hybridization and real time polymerase chain reaction

Abstract

Veteriner hekimliğinde kullanılan antibiyotikler, hayvan dışkısında sıklıkla tespit edilmişlerdir. Bu antibiyotikler havasız çürütme sistemlerindeki hassas mikroflaraya zararlı olduklarından, hayvan gübresinin biyogaz üretiminde sübstrat olarak kullanılması sırasında problem teşkil edebilirler. Bu çalışmada, sık kullanılan bir veteriner antibiyotiği olan oksitetrasiklinin (OTC), gübrenin havasız çürütülmesine olan etkisi araştırılmıştır. Bu kapsamda, biyogaz ve metan üretimleri ile mikrobiyel değişimler incelenmiştir. Çalışma doğrultusunda, iki deney seti kurulmuştur ve bu setler set 1 ve set 2 olarak adlandırılmışlardır. Set 1 de OTC içermeyen gübre substrat olarak kullanılmış ve OTC dışardan eklenmiştir. Set 2 de ise bünyesine OTC enjekte edilmiş ve enjeksiyondan sonra 1., 2., 3., 5., 10., 15. ve 20. günlerde toplanan inek gübresi substrat olarak kullanılmıştır. İki set için de organik yükleme hızları 1,4 kgTVS/m3 gün olarak hesaplanmış ve hidrolik bekletme süreleleri 60 ve 30 gün olarak belirlenmiştir. Toplam katı oranı %5 de tutulmuştur.İki sette de kontrol serum şişelerinde metan yüzdesi %(58±5) olmak üzere metan verimliliği 87-90 L/kgUKM ye ulaşmıştır. Set 1 de, kontrol serum şişesinde 30 gün işletme sonunda biyogaz üretimi sabitlenmiş ve 315 mL ye ulaşmıştır. Bu aşamada biyogaz üretiminde 50 mg/L, 100 mg/L ve 200 mg/L OTC içeren serum şişelerinde %41, %57 ve %61 inhibisyon görülmüştür. OTC nin IC50 konsantrasyonu 68 mg/L olrak hesaplanmıştır. Bu sette işletim süresi boyunca OTC inhibisyonunun azaldığı gözlemlenmiştir. Söz gelimi, 50 mg/L 60 gün işletmenin sonunda kontrol serum şişesindeki değerlere ulaşabilmiştir. Bu da 50 mg/L OTC içeren serum şişesinde yarışmasız inhibisyonu göstermektedir. Serum şişelerinde hidrogentrophik metanojenlerin çoğunlukta oldukları gözlemlenmektedir ve baskın grubun Methanobacteriales olduğu saptanmıştır. Asetoklastik metanojenler Methanosarcinaceae ailesi tarafından temsil edilmişlerdir. Bu sette Methanosarcinaceae ailesi OTC konsantrasyonuyla anlamlı şekilde azalmıştır ve biyogaz ve metan üretimlerinin bu grup ile korele olduğu saptanmıştır. Bakteriyel, Arkeal ve metanojenik16S rDNA gen kopya sayılarındaki değişimlerin OTC inhibisyonunu açıklayıcı olmadığı görülmüştür.Set 2 de, ineğe enjekte edilen OTC nin %10 unun dışkıda atıldığı belirlenmiştir. Bu sette kontrol serum şişelerinde 30 gün işletme sonunda 255 mL biyogaz üretimi elde edilmiştir. Bu aşamada biyogaz üretimlerinde en çok inhibisyon 2. ve 3. günlerde toplanan gübreyle işletilen serum şişelerinde %60 ve %57 olarak görülmüştür. Bu sette aktif Arkea nın çoğunluğunun hidrogentrofik olduğu ve baskın grubun Methanomicrobiales olduğu görülmüştür. Dışkıdaki OTC nin en çok Methanomicrobiales grubuna etkili olduğu fakat işletmenin ilerleyen günlerinde Methanosarcinaceae nin de etkilendiği görülmüştür. Bu çalışmada, bakteriyel ve Arkeal 16S rDNA gen sayılarındaki değişimlerin OTC nin inhibitör etkisini açıklayıcı olmadığı tespit edilmiştir.

Antibiotics used in veterinary practice end up in animal manure and present a threat to biogas production from substrates as such, for they are possibly detrimental to the fragile microflora of anaerobic digestion processes. In this study, inhibitory effects of a commonly used veterinary antibiotic, oxytetracycline on anaerobic digestion of cow manure is examined. Within the context, digester performances in terms of biogas and methane productions, and microbial dynamics were monitored. In this study, two batchwise experiment sets were conducted in serum bottles. In both sets OLR was maintained at 1.4 kgTVS/m3d and HRTs were 60 and 30 days in Set 1 and Set 2 respectively. TS concentration was kept at 5%.In both sets, total methane yields were between 87-90 L/kgTVS with a methane percentage of (58±5)%. In Set 1, OTC in concentrations of 50 mg/L, 100mg/L and 200 mg/L were added to serum bottles operating with non medicated manure. Biogas production continued untill 30 days in the control serum bottle up to a volume of 315 mL and inhibitions were 41%, 57% ve 61% in serum bottles containing 50, 100 and 200 mg/L OTC respectively. IC50 value of the drug was calculated as 68 mg/L. It was recorded that inhibitory effect of OTC regressed during the operation and serum bottle operated with 50 mg/L OTC could reach the values of control bottle at after 60 days. Thereby, in this serum bottle OTC toxicity fitted in with non-competitive inhibition model. In all of the bottles, the majority of the active Archaea was hydrogenotrophic and Methanobacteriales was the dominant order. Acetoclastic methanogens were represented by the members of Methanosarcinaceae family. It was encountered that acetoclastic methanogens decreased significantly by the increased concentrations of OTC, therefore inhibitions in biogas and methane productions were correlated with the decrease of this group. It was found out that changes in the total 16S rDNA copy numbers of bacteria, Archaea and methanogens were not effective in explaining the case of OTC toxicity.In Set 2, a dairy cow was medicated with 20 mg/kg body weight OTC and manure samples collected on days 1, 2, 3, 5, 10, 15 and 20 after medication, were used as substrate in serum bottles. It was found out that, 10% of the OTC injected to the animal was excreted in manure. Biogas production continued in the control serum bottle until day 30 of the operation to a final volume of 255 mL. The most severe inhibitions at this stage were monitored in serum bottles operated with manure collected on the 2nd and 3rd days after medication which were 60% and 57%. In this set majority of the active Archaea was also hydrogenotrophic and Methanomicrobiales was the abundant hydrogentrophic methanogen in the serum bottles. Acetoclastic methanogens were represented by the members of Methanosarcinaceae family. It could be observed that Methanomicrobiales was the most effected group from OTC in medicated manure in the early stages of the digestion, however as the operation progressed Methanosarcinacea was also effected. It was found that changes in the total 16S rDNA copy numbers of the domains Archaea, bacteria and methanogens were not significantly effected by the inhibitory effect of OTC in medicated manure.