Geobacillus kaustophilus fosfotransasetilazın rekombinant üretimi ve biyokimyasal karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, Geobacillus kaustophilus bakterisinin genomunda bulunan ve dizisi bilinen Pta'lara büyük benzerlik gösterdiğinden fosfotransasetilaz geni (EutD) olduğu tahmin edilen (GK3415, KEGG Database) ~1000 bç'lik gen, uygun primerler kullanılarak PCR yöntemiyle çoğaltılıp, pET28a(+) vektöründeki NdeI ve EcoRI klonlama bölgelerine aktarıldı. Aktarılan gen, NdeI ve EcoRI restriksiyon enzim kesimleri ve PCR ile doğrulandı. Daha sonra, DNA dizini, dizi analizine gönderilerek belirlendi. G. kaustophilus EutD genini içeren pET28a(+) vektörü, E. coli BL21 (DE3) hücrelerine transfer edilip, IPTG ile indüklenerek ekspresyonu sağlandı ve rekombinant enzim Ni-NTA afinite kolonu ile saflaştırıldı. SDS-PAGE analizi ile yaklaşık %80 saf olduğu gözlendi. Rekombinant proteinin Pta aktivitesi 100-300 μmol min-1mg-1 protein olarak ölçüldü. Optimum sıcaklık 30-35 ⁰C ve optimum pH değeri 7.5 bulundu. Karakterizasyon çalışmaları sonucunda da Pta'ın ileri reaksiyon substratları, asetil-fosfat ve CoA için Km ve kcat değerleri sırasıyla 284 μM, 153 s-1 ve 207 μM, 171 s-1; geri reaksiyon substratları, fosfat ve asetil-CoA için Km ve kcat değerleri sırasıyla 3.5 mM ve 39 s-1 ve 93 μM ve 23 s-1 olarak bulundu. İlaveten, aktivite üzerine bazı iyonların ve hücre enerji metabolizmasında önemli rol oynayan bazı metabolitlerin etkileri de incelendi. K+ ve NH4+ iyonları Pta aktivitesini arttırırken, Na+ iyonunun inhibe ettiği görüldü. ATP ve α-ketoglutarat, Pta aktivitesini hem ileri hem de geri yönde inhibe ederken, pirüvat ve NADH aktiviteye etki etmemektedir. Farklı tamponda ve pH değerlerinde α-ketoglutarat ve ATP etkisi de ayrıca incelendi. ATP inhibisyonu farklı tampon ve pH değerlerinde farklılık göstermemektedir. α-Ketoglutarat ise HEPES (pH 7.5) ve MOPS (pH 7.5) tampon çözeltilerinde Pta'nın katalizlediği ileri reaksiyonu %30 oranında inhibe ederken, Tris-HCl (pH 7.5) tampon çözeltisinde %90 oranında inhibe ettiği görülmüştür; Tris-HCl tamponu pH 8.0 de ise %30 oranında inhibe etmektedir. Bu sonuçlar, negatif yüklü olan α-ketoglutaratın Pta ile bağlandığı bölgedeki rezidülerin pozitif yükleri ile elektrostatik etkileşim yaptığını ve artan pH ile nötr hale geçtikleri için bağlanmasının zayıfladığını göstermektedir.

In this study, the eutD gene in the genome of Geobacillus kaustophilus GK3415 was amplified using PCR with appropriate primers. The PCR product was subcloned into the NdeI and EcoRI cloning sites of pET28a(+) expression vector. Its DNA sequence was confirmed by DNA sequencing. The pET28a(+) vector containing the eutD gene was transformed into E. coli BL21 (DE3) competent cells. The overexpression of the recombinant protein was achieved by IPTG induction and it was purfied using Ni-NTA affinity column. Its purity was determined to be about 80% by SDS-PAGE analysis. The recombinant protein showed moderate phosphotransacetylase (Pta) activity (100-300 μmol/min/mg protein).The optimum pH and temperature were 7.5 and 30-35 ⁰C, respectively.Furthermore, the kinetic parameters of the recombinant Pta were determined for forward and reverse reactions. In the forward direction, the Km and kcat values for acetyl-phosphate and CoA were 284 μM, 153 s-1 ve 207 μM, 171 s-1, respectively. In the reverse direction, the Km and kcat values for phosphate and acetyl-CoA were 3.5 mM ve 39 s-1 ve 93 μM ve 23 s-1 respectively. The enzyme catalyzes the forward direction about 4-fold faster compared to reverse direction. In addition, effects of some ions and some metabolites (namely, ATP, NADH, pyruvate and α-ketoglutarate) playing central role in cellular energy metabolism have been investigated. K+ and NH4+ ions enhance the Pta activity, whereas Na+ ion was inhibitory. The enzyme was significantly inhibited by ATP and α-ketoglutarate but not markedly affected by pyruvate and NADH. The inhibition by α-ketoglutarate (10 mM) was 30% in HEPES and MOPS buffers (pH 7.5) and 90% in Tris-HCl buffer (pH 7.5); the inhibition was 30% when the pH of Tris-HCl was 8.0. These results indicate that some positive residues on Pta are involved in the interaction with α-ketoglutarate, a negatively charged molecule, and that with increasing pH, the interaction decreases due to loss of the charge on the positive residues.