Geobacillus kaustophilus lipaz yapısında bulunan Met287 ve Asp365 rezidülerinin yönlendirilmiş mutagenez yöntemiyle değiştirilmesi, aktivite ve kararlılığına etkilerinin incelenmesi

Abstract

Bu çalışmada, Geobacillus kaustophilus lipaz enziminin yapısında bulunan Met287 rezidüsü proline (M287P) ve Asp365 rezidüsü alanine (D365A) yönlendirilmiş mutasyon çalışmalarıyla dönüştürülmüştür. Mutasyonlar, DNA dizi analizi ile doğrulandıktan sonra, E. coli BL21 (DE3) hücresinde ekspresyonları gerçekleştirilmiştir. Mutant lipazlar, DEAE-selüloz rezin kullanılarak iki aşamada saflaştırıldı ve SDS-PAGE analiziyle ~43 kDa büyüklüğünde ve >%90 saflıkta oldukları belirlendi. Yaban tip ve mutant lipazların, Ca2+ ve Mn2+ için yarı-maksimal aktivasyon (Ka) değerleri belirlendi. NaCl yokluğunda, her iki metal iyon konsantrasyonuna karşı lipaz aktivitelerinde iki-aşamalı artış görülürken, NaCl varlığında yapan tip ve M287P lipaz için tek-aşamalı, D365A lipaz için ise iki-aşamalı artış görülmektedir. NaCl, hem yaban tip hem de mutant lipazların her iki metal iyonu için Ka değerlerini düşürmektedir. Sıcaklık etkisine bakıldığında, yaban tip 30-70 °C arasında optimum aktiviteye sahipken, M287P mutant 30-50 °C ve D365A mutant 50-70 °C arasında yüksek aktivite göstermektedir. NaCl varlığında yapılan sıcaklık kararlılık deneyleri, kalsiyumun yaban tipin yarı-ömrünü arttırdığını, mutantların ise yarı-ömürlerini azalttığını göstermektedir. Ayrıca, Sirküler Dikroizm Spektroskopisi ile yaban tip ve mutant lipazların erime sıcaklık (Tm) değerleri belirlenmiştir. Yaban tip lipazın sadece EDTA ve Ca2+ varlığında Tm değerleri, sırasıyla, 70 °C ve 77.5 °C; M287P lipazın 70 °C ve 69.7 °C; D365A lipazın ise 74.7 °C ve 75.5 °C olarak bulunmuştur. NaCl, yaban tip ve mutant lipazların Ca2+ ve Mn2+ afinitesini arttırırken, Tm değerlerini birkaç derece düşürmektedir. Bu sonuçlar, M287P-lipazın aktivitesi için kalsiyuma olan afinitesi artarken kalsiyuma-bağlı termal kararlılığını kaybettiğini; D365A-lipazın sadece EDTA varlığında daha kararlı olduğu, kalsiyum varlığında ise daha çok agregasyona giderek aktivitesini kaybettiğini göstermektedir

In this study, the residues Met287 and Asp365 of Geobacillus kaustophilus lipase were substituted to proline and alanine, respectively, by site-directed mutagenesis. The mutations were confirmed by DNA sequencing. The mutants were expressed in E. coli BL21 (DE3) and purified by DEAE-cellulose using two-step purification method. The molecular masses of the variants were ~43 kDa and the purity were about 90% as determined by SDS-PAGE analysis. The half-maximal activation (Ka) values of wild-type and mutant lipases for Ca2+ and Mn2+ ions were determined in the absence and presence of NaCl. Biphasic responses were observed for wt lipase as well as mutant lipases in the absence of NaCl. Whereas monophasic response for wt lipase and M287P lipase and biphasic response for D365A lipase were observed in the presence of NaCl. NaCl decreases the Ka values of both wt and mutant lipases for Ca2+ and Mn2+. The wt lipase has high activity at the temperature range of 30-70 °C while M287P and D365A lipases show high activity at 30-50 °C and 50-70 °C, respectively. Thermal stability experiments show that calcium enhances the half-life of wt-lipase whereas reduces that of mutants. Also, (Tm) values of wt and mutant lipases were determined by circular dicroism spectroscopy in the presence and absence of Ca2+. Tm values for wt lipase in the absence (EDTA alone) and presence of calcium were 70 °C and 77.5 °C, while 70 °C and 69.7 °C for M287P lipase and 74.7 °C ve 75.5 °C for D365A lipase, respectively. Although NaCl increases the affinity of the wt and mutant lipases for Ca2+ and Mn2+, it reduces their Tm values. These results show that calcium-dependent thermal stability of M287P lipase decreases while the affinity for Ca2+ ion increases. Also D365A lipase is more stable in the presence of EDTA whereas loses its activity in the presence of calcium due to aggregation