Site-directed-mutagenesis of metallo-beta-lactamase-like gene of solibacter usitatus

Abstract

Tıp alanında en sık kullanılan antibiyotik grubu olan β-laktam antibiyotikleri, penisilin bağlayıcı proteinlere spesifik olarak bağlanarak bakteriyel hücre duvarı sentezini inhibe ederler. β-laktam antibiyotiklerine karşı en önemli direnç gelişimi dirençli bakteriler tarafından β-laktamaz enzimlerinin üretimidir. Tor Vergata Üniversitesi'nde (İtalya) yürütülen bir çalışmada, yedi ayrı bakteriden metallo-β-laktamaz (MβL) benzeri proteinler tespit edilmiş, olası genler klonlanmış, ancak hiç birinde β-laktamaz aktivitesi gözlenmemiştir. β-laktamaz aktivitesinin görülmeyişine cevap bulabilmek amacıyla, Fluoribacter gormanii'nin fonksiyonel MβL'si (FEZ) ile yüksek homoloji gösteren Solibacter usitatus metallo-β-laktamaz benzeri proteini (Sol_65) daha detaylı analiz için seçilmiştir.Sol_65 and FEZ proteinlerin üç boyutlu yapılarının birbiriyle örtüştürülmesi sonucunda iki proteinin yapısal farklılıkları ortaya çıkmıştır. Buna göre Sol_65'in aktif bölgesinde yer alan 223. (Asn223: N223) ve 266. (Tyr266: Y266) amino asitlerin yarattığı olası bir sterik engellemenin, β-laktam halkasının aktif bölgeye girişini engelleyebileceği düşünülmüştür. Bunun üzerine, yönlendirilmiş mutagenez ile Sol_65'in 223. ve 266. amino asitlerinin FEZ proteininin aynı pozisyonlarında (223. ve 226.) bulunan amino asitler ile değiştirilmesi ve aynı işlemin FEZ için de yapılması kararlaştırılmıştır.Bu çalışma, hem Sol_65 (N223G) hem de FEZ (G223N) proteinlerinin 223. amino asitinin yönlendirilmiş mutasyonu ile ilgili deney sonuçlarını kapsamaktadır. Öncelikle, amaçlanan mutasyonun Sol_65 proteinine yerleştirilmesi için kalıp bir plazmit (pR_pelBSol65) oluşturulmuştur. FEZ mutasyonu için, daha önce oluşturulmuş olan kalıp plasmid (pET24Fez) kullanılmıştır. Restriksiyon enzim kesimleri ve DNA sekansı ile mutasyonun doğruluğu kanıtlanmış, ancak antibiyotik test sonuçlarına göre rekombinant suşun çok zayıf β-laktamaz aktivitesi gösterdiği bulunmuştur.Anahtar Kelimeler: β-laktamaz, Metallo-β-laktamaz, Yönlendirilmiş mutagenez, Solibacter usitatus, Fluoribacter gormanii, FEZ proteini.

Beta-lactam (β-lactam) antibiotics, which are the most widely used antibiotic group in medicine, bind specifically to penicillin-binding proteins and inhibit bacterial cell wall synthesis. The most important resistance development against β-lactams is the production of β-lactamase enzymes by resistant bacteria. In a previous work carried out in `University of Tor Vergata (Italia)`, metallo-β-lactamase-like (MβL) proteins from seven environmental bacteria were identified and putative genes were cloned, however no β-lactamase activity was obtained from any of them. Solibacter usitatus MβL-like ORF (Sol_65) has been chosen for further analysis to find an answer for the lack of β-lactamase activity, since its amino acid sequence was highly homologous to the functional MβL of Fluoribacter gormanii (FEZ). Overlapping of the two protein's 3D structures had highlighted the structural differences between Sol_65 and FEZ proteins and it was predicted that amino acids at 223rd (Asn223: N223) and 266th (Tyr266: Y266) positions in the active center of Sol_65 could be responsible for the possible steric hindrance that prevent the entry of the β-lactam ring in the active site. It was decided to change those amino acids with the once present in FEZ at the same sites (223rd and 226th) and vice versa by site directed mutagenesis. Present study covers experimental results of site directed mutagenesis of 223rd amino acid in both Sol_65 (N223G) and FEZ (G223N) proteins. First, a template plasmid to be used in site directed mutagenesis was prepared (pR_pelBSol65) to introduce selected mutation into Sol_65. Template plasmid for FEZ (pET24Fez) was prepared in a previous study. Although, restriction enzyme digestion and DNA sequencing prove that the mutation was successful, the result of the antibiotic test showed that recombinant strain has very poor β-lactamase activity.Key Words: β-lactamase, Metallo-β-lactamase, Site-directed-mutagenesis, Solibacter usitatus, Fluoribacter gormanii, FEZ protein.