Metisilin dirençli Staphylococcus aureus`dan rekombinant lipaz üretimi, karakterizasyonu ve immobilizasyonu

Abstract

Lipazlar çok sayıda esterleşme, transesterleşme ve hidroliz tepkimelerini katalizlerler. Bu enzimler süt, gıda, kozmetik, parfüm, dericilik, deterjan sanayi, çevre yönetimi ve biyomedikal uygulamalar gibi birçok alanda endüstriyel ölçekte kullanılmaktadır. Bu enzimler patojen stafilokolar tarafından da üretilmekte ve patojenitede önemli rol almaktadır. Bu tezin amacı patojen stafilokoklardan rekombinant lipaz üretilmesi ve karakterize edilmesidir. Bu çalışmada, lipaz üretiminde subklinik mastitisli ineklerden izole edilen S.aureus izolatları kullanıldı. Zeytinyağı-Rhodamine B ile zenginleştirilmiş besiyerinde en fazla lipaz üreten izolatın S.aureus 35 izolatı olduğu belirlendi. Rekombinant enzim üretiminde kullanılan bu izolat klasik mikrobiyolojik ve 16S rRNA gen dizileme metodu kullanılarak tanımlandı. Rekombinant enzim E. coli'de eksprese edildi, nikel affinite kolon kullanılarak saflaştırıldı ve biyokimyasal olarak karakterize edildi. Enzimin molekül ağırlığı SDS-PAGE ve MALDI-MS ile 43 kDa olarak belirlendi. Enzimin optimum pH ve sıcaklığı sırasıyla pH 8.0 ve 25 °C olarak belirlendi. Bu tez çalışmasında ayrıca farnesolün S. aureus 35 izolatının büyümesi ve lipaz aktivitesine etkisi de çalışıldı. Farnesolün rekombinant lipaz için mixed-type bir inhibitör (Ki:0.2 mM, Ki-1: 1.2 mM) olduğu ve S. aureus 35 izolatının büyümesini de inhibe ettiği (50 μM) belirlendi. Tez çalışmasının en son kısmında ise rekombinant lipaz ticari bir matriks olan `İmmobead 150A` üzerine kovalent olarak immobilize edildi ve immobilize enzimin karakterizasyonu çalışıldı.

Lipases catalyze esterification, transesterification and hydrolytic reactions. These enzymes have been used in many industries such as milk, food, cosmetics, perfume, leather, detergent industry and also in environmental management and in biomedical applications. These enzymes are produced by pathogenic staphylococci and takes an important role in their pathogenicity. The aim of this thesis is to produce recombinant lipase from pathogenic staphylococcus and its biochemical characterization. In this study, S.aureus isolates from a cow with subclinical mastitis were used for production of a novel recombinant enzyme. It was observed that S.aureus 35 has maximum lipase activity in the media containing olive oil-Rhodamine B. This isolate used in production of recombinant enzyme was identified using the classical microbiological characteristics and 16S rRNA gene sequencing methods. The recombinant enzyme was expressed in E.coli BL21(DE3), purified using nickel affinity column chromatography and biochemically characterized. The molecular mass of lipase enzyme was 43 kDa by SDS-PAGE and MALDI-MS analyses. The optimum temperature and pH for this lipase were found as 25°C and 8.0, respectively. Furthermore, in this thesis the effect of farnesol on the growth of S. aureus 35 and on the lipase activity were also studied. It was found that Farnesol is a mixed-type inhibitor for recombinant lipase (Ki: 0.2 mM. Ki-1: 1.2 mM) and also inhibits growth of S. aureus 35 isolates (50 μM). Finally in this thesis this novel enzyme was successfully immobilized covalently onto a commercial immobilization matrix called Immobead 150A and immobilized enzyme properties were examined.