Coiled-coil domain-containing 124 (CCDC124) proteininin işlevleri ve hücre-altı konumunun translasyon sonrası mekanizmalarla düzenlenmesi

Abstract

Mantardan insana kadar tüm ökaryotlarda korunmuş olan Coiled-coil domain containing 124 (Ccdc124) proteini, memeli hücrelerinde yeni tanımlanmış fonksiyonel bir proteindir. İnsan hücrelerinde lokalizasyonu hücre döngüsünün interfaz evresinde sentrozomda; mitozun post-anafaz evresinden sitokinetik bölünmeye kadar orta-cisimcikte (midbody) görülmektedir. Daha önce yapılan çalışmalarda Ccdc124 proteinini kodlayan genin susturulması veya ifadesinin artırılması durumunda hücrelerin bölünemediği ve çok çekirdekli hücrelerin meydana geldiği belirlenmiştir [1], [2], [3], [4]. Yapılan bu tez çalışmasının ilk kısmında, Ccdc124 proteininin hücre içi potansiyel protein etkileşim partnerlerini bulmaya yönelik yapısal biyoinformatik çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Belirlenen adayların etkileşimleri immünboyama ve birlikte çöktürme deneyleri ile teyit edilmiştir. Çalışmanın ikinci kısmında, Ccdc124 proteininin translasyon sonrası modifikasyon bölgelerinden Y38, S122 ve S141 aminoasitleri, N veya C-terminalinde farklı etiketlere sahip Ccdc124 vektörleri kalıp olarak kullanılarak yönlendirilmiş mutagenez tekniği ile mutasyona uğratılmıştır. Ardından ilgili vektörlerle transfekte edilen hücrelerde protein stabilite ve degradasyon durumları açısından immünoblot, hücre içi lokalizasyon değişimi açısından ise immünboyama teknikleri ile analiz edilmiştir. Yapılan immünblot çalışmalarında farklı protein degradasyon profilleri gözlemlenmiştir. İmmünboyama çalışmalarında ise tüm mutantlarda sentrozom lokalizasyonu bozulmakla birlikte orta-cisimcik lokalizasyonu etkilenmemiştir. Ek olarak bazı mutantlarda daha önce görülmeyen hücre içi ve dışı nükleik asit-Ccdc124 örtüşmeleri gözlemlenmiştir. Çalışmanın son kısmında ise, Ccdc124'ün translasyon sonrası uğradığı fosforilasyon durumlarının belirlenmesi amaçlanmıştır. In vitro kinaz deneyi ile Kazein Kinaz 2 (CK2) tarafından fosforillendiği önceki deneysel çalışmalarla gösterilmiş olan Ccdc124'ün [1], CK2 fosforilasyonu teyit edilerek, gerek literatürdeki veriler, gerekse gerçekleştirdiğimiz biyoinformatik araştırmalar çerçevesinde potansiyel kinazlarından biri olarak tahmin edilen PLK1 ile etkileştiği ve fosforilasyona uğradığına yönelik veriler elde edilmiştir.

The Coiled-coil domain containing-124 (Ccdc124) protein, which is conserved in all eukaryotes, from fungi to human, is a newly identified functional protein in mammalian cells. It localizes in centrosomes in the interphase of cell cycle; then from post-anaphase stage, it translocates to midbody untill cytokinetic divison completion. Previous studies have shown that the silencing or over-expression of the gene coding for the Ccdc124 protein results in non-divided and multinuclear cells [1], [2], [3], [4]. In the first part of this thesis, structural bioinformatics studies were carried out to find intracellular potential protein interaction partners of the Ccdc124 protein. Interactions of the identified candidates have been confirmed by immunostaining and co-Immunoprecipitation experiments. In the second part of the study, amino acids Y38, S122 and S141 from the post-translational modification regions of the Ccdc124 protein were mutated by site-directed mutagenesis technique by using Ccdc124 vectors with different labeled at the N- or C-terminus as a template. Subsequently, immunoblot experiments were performed in terms of protein stability and degradation status; and immunostaining in terms of intracellular localization change in cells transfected with the mutant vectors. Different protein degradation profiles were observed from immunoblot studies. All mutants have not affected the midbody localization as well as disrupted the centrosome localization of Ccdc124. In addition, in some mutants, intracellular and extracellular nucleic acid-Ccdc124 overlaps that have not been seen previously have been observed. In the last part of the study, it was aimed to determine the phosphorylation status of Ccdc124 after translation. Casein Kinase 2 (CK2) phosphorylation on Ccdc124, which has been demonstrated in previous experimental studies [1], confirmed; and data obtained about both interaction and phosphorylation of Ccdc124 by PLK1 which is the potential candidate kinase according to both data from literature and performed bionformatics studies.