Molecular deletion patterns and RFLP analysis in Turkish Duchenne/Becker muscular dystrophy (DMD/BMD) families

Abstract

VIII ÖZET Duchenne kas distrof isi (DMD) erkeklerde 3300 de bir rastlanan ve X kromozomuna bağlı çekinik karakterde bir kas bozukluğudur. Hastalığın alelik bir şekli olan Becker kas distrof isinin (BMD) görülme sıklığı ise her 30000 erkekte birdir. Olguların üçte ikisinde hastalıklı gen taşıyıcı annelerden kalıtılmaktadır, geri kalan üçte biri ise yeni mutasyonlardan oluşmaktadır. DMD geni yaklaşık 2500 kilobaz uzunluğundadır ve sarcolemmada bulunan distrofin isimli bir proteini kodlamaktadır. Duchenne kas distrof isine neden olan mutasyonların yaklaşık yüzde 60 ının delesyonlardan, yüzde altısının ise duplikasyonlardan kaynaklandığı bilinmektedir. Geri kalanlarda ise hastalığa translokasyonların, nokta mutasyonların veya mikrodelesyonların neden olduğu düşünülmektedir. Bu çalışma kapsamında, Türk toplumunda DMD ye neden olan delesyonlar iki ayrı çoklu (Multiplex I ve Multiplex II) gen amplif ikasyon sistemi kullanılarak incelendi. Toplam 61 aileden 69 hasta çocuk delesyon saptanması için tarandı. Duchenne ve Becker delesyonlar inin taranmasını çok kısa bir zamana indiren Multiplex I ve Multiplex II gen amplif ikasyon sistemi kullanılarak akrabalık ilişkisi bulunmayan 61 DMD'li hastanın 3S'sinde (yüzde 5E ) hastalığın delesyondan kaynaklandığı gözlendi. Delesyonların çoğunluğunun (E8/3E) genin orta bölgesinde geri kalanlarının ise genin 5' ucundan 500 kb uzaklıktaki bir bölgede bulunduğuIX saptandı. Bu çalışmada 45 sonlama noktası Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction; PCR ) kullanılarak belirlendi. Geri kalanlar ise cDNA analizi ile tanımlandı. Delesyon sonlama noktalarının genellikle genin üç değişik hotspot bölgesinde yoğunlaştığı belirlendi. Bu çalışmada, Türk toplumu için Multiplex II gen amplif ikasyon sisteminin, Multiplex I gen amplifikasyon sisteminden daha informatif olduğu saptandı. Ayrıca söz konusu iki sistemin birlikte kullanılmasının doğum öncesi tanı için önemli bir olanak sunduğu gözlendi. Delesyon bulunmayan ailelerde indirekt bir yaklaşım olan Restriksiyon Fragmenti Uzunluk Polimorf izmî (Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP ) analizi kullanıldı. PCR yöntemi kullanılarak saptanabilen üç değişik gen-içi polimorfizm için çalışma kapsamına alman annelerin informatif olup olmadıkları araştırıldı. Taşıyıcı ve doğum öncesi tanı için bir strateji belirlemek amacı ile her bir polimorf izmin görülme sıklığı saptandı. pERT87. 15/XmnI ' in Türk toplumu için diğer ikisinden daha informatif, ve annelerin yüzde 69 unun bu üç polimorf izmden en az biri için heterozigot olduğu bulundu. Doğum öncesi tanı ve taşıyıcı tanısı verebilme olanaklarını belirlemek ve tanıdaki kısıtlamaları saptamak amacı ile hastalığı taşıyan bazı aileler çalışma kapsamına alındı. Yedi ailede ise istek üzerine DNA analizi ile doğum öncesi tanı gerçekleştirildi.

VI ABSTRACT Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is one of the most common X-linked recessive neuromuscular disorders, affecting one in 3300 males with little ethnic variation. Becker Muscular Dystrophy (BMD), is the allelic form of DMD and has an incidence of one in 30000 male births. Two-third of cases inherit the defective gene from a carrier mother and one- third of affected males are the result of new mutations. The gene of DMD is 2500kb long and codes for a protein called dystrophin which is localized on the sarcolemma. About 60 per cent of mutations are deletions and 6 per cent are duplications within the dystrophin gene whereas the rest are translocations, point mutations or microde letions. The aim of this study was to perform deletion screening in the Turkish population and establish a strategy for carrier detection and prenatal diagnosis. Two separate multiplex gene amplification sets were used to amplify IB different deletion-prone exon sequences of the DMD/BMD gene by polymerase chain reaction (PCR). 69 boys afflicted with DMD/BMD from 61 different families were examined by using PCR to detect the partial intragenic deletions within the gene. The application of multiplex gene amplification systems to the screening of DMD/BMD deletions had drastically reduced the time required for analysis, and the results indicated that this simple and rapid technique offered great potential in the prenatal diagnosis of DMD in Turkey. Deletions of oneVII or more exons were identified in 32 unrelated DMD/BMD patients establishing a deletion frequency of 52 per cent among the Turkish DMD patients. The majority of these deletions (28/32) were found to be localized within the central region of the dystrophin gene. The remaining deletions were mapped to proximal hotspot at approximately 500kb from the 5 'end of the gene. We could also precisely identify 45 deletion endpoints in this study by using PCR. A subsequent cDNA analysis was required to delineate the deletion precisely. The deletion breakpoints were found to be mainly clustered in three different hotspot regions. In nondeletion families, linkage analysis of polymorphic loci that lie within the dystrophin gene was performed. PCR based assays were used to screen heterozygosity of mothers for three different polymorphisms, pERTB7.15/BamHI, pERT87. 15/XmnI and pERT87.B/TaqI. The expected heterozygote frequency of each polymorphism was calculated to establish a strategy for carrier identification and prenatal diagnosis in Turkish patients. pERTB7. 15/XmnI was found to be more informative than the other polymorphisms. Sixty-nine per cent of all mothers at risk were found to be heterozygous for at least one of the three intragenic RFLPs studied. In order to discuss the possibilities and limitations of carrier identification and prenatal diagnosis, some of the family studies were included into this thesis, and in the framework of this study prenatal diagnosis was offered to seven families upon request.