Molecular diagnosis of two heritable bleeding disorders: Hemophilia A and hemophilia B

Abstract

ÖZET Genetik hastalıklar» önlemede en etkin yollardan biri taşıyıcı belirlemesi ve doğum öncesi erken tanıdır. Hemofili A ve B X-kromozomuna bağlı kalıtsal kan hastalıklarıdır ve pıhtılaşmada rol oynayan faktör VIII ve IX proteinlerinde olan bir hatadan kaynaklanmaktadır. Hemofili'lerin moleküler tanısında kullanılan yaklaşımlar dolaylı ve direkt olmak üzere ikiye ayrılır. Dolaylı yöntem her iki hastalığın moleküler tanısında kullanılmakta, direkt yaklaşım ise, daha kesin sonuç verdiği halde, hemofili A geninin karmaşıklığı yüzünden ancak hemofili B' ye uyarlanabilmektedir. Bu tez kapsamında, Türk toplumunda FVIII ve IX genlerindeki polimorfik bölgelerin genotipik dağılımını ve moleküler tanı stratejilerini belirlemek amacıyla 50 - 235 X kromozomu polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak dolaylı tanı yöntemiyle analiz edilmiştir. Bu çalışma sonucunda, faktör VIII için dört, faktör IX için altı genetik markör kullanılarak hemofili A' nın yüzde 70, hemofili B' nin yüzde 83' ünde dolaylı yaklaşımla moleküler tanı hizmeti verilebileceği saptanmıştır. Özellikle faktör VIII de HindUl ve Sfl4, faktör IX da ise Dde/ ve HhaV nın informatif markörler oldukları bulunmuştur. Bu polimorfik bölgelerin analizi Türk toplumunun genetik yapısının Kuzey Amerika ve Avrupa toplumlarına göre az da olsa farklılık gösterdiğini ve etnik açıdan Doğu toplumlarına da yakınlığı olduğunu ortaya çıkarmıştır. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda, 46 hemofili A ailesinde 78 kadının taşıyıcı durumları belirlenmiş ve hemofili A' da beş, hemofili B' de ise iki aileye doğum öncesi erken tanı uygulanmıştır. GAWTS ( `Genomic Amplification With Transcript Sequencing` ) metodu kullanılarak, dört hemofili B hastasında bozukluğa neden olan mutasyonlar bulunmuş ve bu çalışma çerçevesinde henüz literatürde hiç tarif edilmemiş iki mutasyon tanımlanmıştır. Bunlardan birincisi exon c/ıntron c bölgesinde 6707 bazında (G->C) olup ` splicing ` bozukluğuna, diğeri ise 31253 bazında (T->G) Phe378->val değişikliğine yol açmaktadır. Ayrıca diğer toplumlarda daha önce görülen iki mutasyon daha belirlenmiştir; bunlar 31008 bazında (C->T) Thr296->Met, 31220 bazında (G->A) Gly367->Arg değişimleridir. Hemofili B'de görülen nokta mutasyonlarının tanımlanması, faktör IX proteininin yapısı ve işlev mekanizması arasındaki ilişkiyi anlamaya katkıda bulunacak ve hastalığın moleküler tanısına ve önlenmesine yardımcı olacaktır.

ABSTRACT The identification of carrier individuals and early prenatal diagnosis provides efficient means to prevent the inheritance of a genetic disorder. Two molecular approaches, namely linkage analysis and direct identification of the causative mutation, exist for this purpose. The former approach has been used in molecular diagnosis of the two X-linked recessive bleeding disorders, hemophilia A and hemophilia B, that result from an absence or a deficiency of clotting factor VIII and IX, respectively. However, due to the complexity of the hemophilia A gene, the latter approach which is superior in accuracy to linkage analysis is only applicable for diagnosis of hemophilia B. To determine the genotypic distribution of polymorphic sites associated with FVIII and FIX genes and establish molecular diagnostic strategies by linkage analysis in the Turkish population, a sample of 50 - 235 unrelated X chromosomes were analyzed using Polymerase Chain Reaction (PCR). Molecular diagnosis of hemophilia A and B was found to be possible in 70 and 83 percent of the population, respectively, with the use of four marker loci for factor VIII and six marker loci for factor IX. Two marker loci Hindu and Sfl4 in factor VIII gene and Ddel and Hha/ in factor IX gene were found to be the informative markers. The analysis of the polymorphic loci also revealed that the genetic make up of the Turkish population is slightly different than Caucasians and have an Oriental component. Based on the above population study, in 46 hemophilia A afflicted families, carrier statuses of 78 females have been determined and five prenatal diagnosis in hemophilia A and two in hemophilia B families were performed. Using Genomic Amplification With Transcript Sequencing (GAWTS), causative mutations in four hemophilia B patients were identified. Two novel transversions were found at bases 6707 (G->C) and 31253 (T->G) that resulted in a splicing defect at the donor splice junction adjacent to exon c and a missense mutation (Phe378->val), respectively. One transition at base 31008 (C->T) resulting in a missense mutation Thr296->Met and a second transition at 31220 (G->A) causing another missense mutation in Gly367>Arg were also delineated. Characterization of point mutations will contribute to our understanding of the structure/function relationship of the factor IX protein and provide accurate diagnosis and prevention of hemophila B in future.