Studies on the screening of cystic fibrosis mutations in Turkish of families

Abstract

VI ÖZET Kistik Fibrozis (CF) otozomal çekinik karakterde en ciddi kalıtsal hastalıklardan biridir. Yaklaşık her 2500 doğumda bir görülmektedir. Hastalık, CF olgularının çoğunluğunda, genin 10. eksonundaki 3bç.'lik bir delesyondan (AF508) kaynaklanmaktadır. Literatürde şimdiye kadar 375' den fazla hastalığa neden olan mutasyon tanımlanmıştır. Toplumlara göre bu mutasyonlarm dağılımı değişmektedir. CF'e neden olan mutasyonların belirlenmesi hastalığın patogenezinin anlaşılması bakımından çok önemlidir. Türkiye'de CF mutasyonlarının moleküler temelinin anlaşılması ve doğum öncesi tanı isteyen Türk CF ailelerinde doğrudan mutasyon tespitiyle prenatal tanı olanaklarının araştırabilmesi için gen içerisindeki mutasyon görülme sıklığı çokça olan, birinci nükleotid bağlanma bölgesi (NBF1), uygun polimeraz^incir j^ksjyonu (PCR) teknikleri kullanılarak tarandı. 40 Türk CF ailesinden 80 CF kromozomu heterodupleks oluşum analizi ile incelendi. Hastalığa neden olan mutasyonunların, olguların yüzde 15' inde AF508, ve yüzde 5.5' inde 1677delTA kaynaklandığı belirlendi. Hastalığın ağır seyreden formlarında olguların yüzde 28.6' ında AF508 mutasyonu saptandı. AF508 ve 1677delTA saptanmayan olgularda, CF' e neden olan mutasyonları taramak amacıyla, birden fazla mutasyona özgü alel yansıtıcı sistemide (MARMS) içeren çoklu bir PCR analiz yöntemi laboratuvar koşullarımıza uyarlanılarak uygulamaya konuldu ve ekson11 içinde sıkça rastlanan mutasyonlar için tarama çalışmaları gerçekleştirildi. Bu çalışmada olgulardan biri G542X için, 3' ü R560T için heterozigot bulundu. Restiriksiyon enzim analizi uygulanan diğer tarama çalışmalarında, bu çalışmaya dahil edilen hasta ve taşıyıcılarda V520F, C524X ve R347X mutasyonlarının bulunmadığı saptandı. Denature edici gradyent gel elektroforez (DGGE) metodu, CF geninin EksonlO bölgesi içindeki herhangi bir değişikliği tespit etmek için ilk defa bu çalışma kapsamında laboratuvarımızda uygulanmaya başlandı ve, CF taşıyıcı ve hastaları tarandı. Bir homozigot ve bir heterozigot iki olguda DGGE ve doğrudan dizi analizi metodları beraberce uygulanarak 1540' inci bazda A' nın G' ye dönüşümüyle oluşan dizi değişikliği saptandı. Bu değişiklik ayrıca restiriksiyon enzim kesimi analizi ile kanıtlandı. Bu çalışma kapsamında heterodupleks oluşum analizi kullanılarak beş Türk CF ailesine doğum öncesi tanı verildi.

ABSTRACT Cystic Fibrosis (CF) is one of the most severe autosomal recessive genetic disorders. Its frequency is approximately one in every 2500 births. The majority of the CF cases are caused by a 3bp deletion (AF508) in ExonIO of the CF gene. More than 375 different CF mutations have been detected so far. The frequency of these mutations vary in different populations. Identification of all possible mutations that cause CF is essential for the understanding of the pathogenesis of the disease. In order to determine the molecular basis of CF in Turkey and investigate the possibilities of prenatal diagnosis by direct detection of mutations in Turkish CF families requesting prenatal diagnosis, one of the 'hot spot' regions, namely first nucleotide binding fold (NBF1), within the gene was screened by using appropriate polymerase chain reaction (PCR) techniques. Heteroduplex formation analysis of 80 CF chromosomes of 40 Turkish CF families revealed the presence of AF508 and 1677delTA mutations in 15 and 5.5 per cent of cases respectively. AF508 was found to be associated with the severe form of the disease in 28.6 per cent of cases. A multiplex PCR analysis system, including multiplex allele refractory mutation system (MARMS) was established in order to screen frequent mutations of Exon11 in the remaining non-AF508 and non-1 677delTA chromosomes. This screening study has indicated the presence of G542X mutation in one heterozygous case and the presence of R560T mutation in three heterozygous cases. Further screening studies by using restriction enzyme analysis revealed the absence of mutations namely V520F, C524X and R347X in patients and carriers included into this study. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) method has been established for the first time in our laboratory to screen CF carriers and patients for any base difference in ExonIO of the CF gene. A to G sequence variation at base 1540 has been detected in one homozygous and one heterozygous individual by combining two techniques, namely DGGE and direct sequencing. The presence of this variation was also confirmed by restriction enzyme analysis of the PCR product. Prenatal diagnosis could be offered to five Turkish CF families by using the heteroduplex formation analysis.