Screening for point mutations in the factor VIII gene by denetaring gradient gel electrophoresis

Abstract

Hemofili A gibi genetik hastalıklarda taşıyıcı belirlemesi ve doğum öncesi tanıda kesinliği sağlayan moleküler yaklaşımlar, bağlantı analizi ve mutasyonların doğrudan tespitidir. DNA bağlantı analizi, hemofili A'ya sebep olan FVIII geninin büyüklüğü nedeniyle en önemli tanı aracıdır. Diğer taraftan, bağlantı analizi, bir çok aile bireyinin katılımını gerektirmesi, o aile için informatif ve tercihen geniçi bir marköre ihtiyaç duyulması gibi bir takım sınırlamalara sahiptir. Taşıyıcı belirlemesi veya doğum öncesi tanı isteyen beş hemofili A ailesinin bireyleri, daha önce hemofili A'nın bağlantı analizinde kullanılan üç markörle incelendi. Üç ailede anne adaylarının taşıyıcı olmadığı belirlendi. İki doğum öncesi tanı, fetüslerden birinin normal ve diğerinin hasta olduğunu gösterdi. Hemofili A ailelerinde bağlantı analizini daha etkin kılmak amacıyla FVIII geninin 13. intronunda bulunan (CA)n ardışık dizi polimorfizm analizi çalışmaları başlatıldı. Yedi aile bu polimorfizm için analiz edildi. İki ailede daha önce diğer markörlerle yapılan taşıyıcı belirlemesi ve doğum öncesi tanı sonuçları (CA)n ardışık dizi polimorfizm analizi ile doğrulandı. Denature Edici Gradyent Gel elektroforezi, büyük genlerde mutasyonları tespit etmekte kullanılan hızlı tarama metodlarından biridir. Bu metod, DNA parçalarının, erime (çözülme) özelliklerine dayanarak DNA denature edici ajanların lineer gradyentini içeren bir gel sisteminde ayrılmalarını içerir. Kısmen çözülmüş DNA parçaları - mutasyonlar, DNA parçalarının bu çözülmüş bölgelerindedir - normal ve mutant DNA'ların ayrılması için gereklidir. FVIII geninin yüzde 10'u, 78 Türk hastasında 11., 23. ve 24. eksonları analiz etmek suretiyle tarandı. Ekson 11 'de bir ve Ekson 23'de iki olası mutasyon saptandı. Ekson 11 'de olası mutasyonu taşıyan hastanın kısmi dizi analizi normal bireylerin dizileriyle karşılaştırıldığında hiçbir dizi değişikliği görülmedi. Bu çalışma, FVIII geninin moleküler patolojisini araştırmak ve Türk hastalarında kesin doğum öncesi tanı olanağı sağlamak amacıyla, DGG elektroforezinin FVIII gen mutasyonlarını tarama çalışmasını başlatmıştır.

In genetic disorders such as hemophilia A, accurate carrier identification and prenatal diagnosis is achieved by molecular approaches namely linkage analysis and direct identification of mutations. DNA linkage analysis is the major diagnostic approach because of the large size of the FVIII gene causing hemophilia A. However, linkage analysis has a number of limitations such as the requirement of the participation of many family members and the need of an informative and preferably intragenic marker for the family. Family members of five hemophilia A afflicted families that requested carrier identification and/or prenatal diagnosis have been analyzed with three markers that had previously been used in linkage analysis of hemophilia A. In three families expecting mothers were diagnosed as non- carriers by exclusion analysis. The two prenatal diagnosis revealed that one fetus was a normal female and the other one was an affected male. In order to improve the effectiveness of linkage analysis in families afflicted with hemophilia A, the preliminary analysis of a hypervariable (CA)n repeat polymorphism located at Intron 13 of the Factor VIII gene was carried out. Seven families were analyzed using (CA)n repeat polymorphisms. In two families carrier identification and prenatal diagnosis carried out with previous markers were confirmed with (CA)n repeat analysis. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) is one of the screening methods used to identify point mutations rapidly, in large genes. It involves the separation of DNA fragments according to their melting properties in a gel system that contains a linear gradient of DNA denaturants. Partially melted fragments are required for separation of normal and mutant DNA, where mutations fall in the melted region of the fragments. Ten per cent of the FVIII gene was screened by analyzing exons 11, 23, and 24 of 78 Turkish patients. One putative mutation in Exon 1 1 and two putative mutations in Exon 23 were detected. Partial sequencing of Exon 11 from the patient presumed to have a base change did not reveal any sequence alteration when compared with the sequence of Exon 11 in a normal individual. This work has initiated and established the use of DGGE analysis in screening for mutations in the factor VIII gene of Turkish patients with the aim of providing accurate prenatal diagnosis and studying the molecular biology of the gene.