Sphingolipidomics: Qualification and quantification of sphingolipids in yeast

Abstract

Hesapsal yöntemlerle belirlenen olası ilaç hedeflerinin deneysel olarak dogrulanmasınihai hedefini güden bu çalısmada, S. cerevisiae'nın bilinen sifingolipid sentezimekanizmasının daha iyi anlasılması, mayanın ürettigi sifingolipid metabolitlerinin tayinive miktarlarının belirlenmesi amacıyla BY4743 ve bu sustan üç homozigot ve dörtheterozigot delesyon susu olarak yaratılan ino1D/ino1D, slc1D/slc1D, ser2D/ser2D,INO1/ino1D, SLC1/slc1D, LCB1/lcb1D, ve LCB2/lcb2D susları incelenmistir. Bu amaçla,hücreler kesikli üretim ile zengin ve minimal besi ortamlarında büyütülmüs, ino1D/ino1Dsusu ayrıca inositol içermeyen besi ortamında da büyütülerek incelenmistir. Zengin besiortamında kesikli üretimde slc1D/slc1D susunun ana sustan daha yüksek miktarlarda hücreürettigi, ser2D/ser2D susunun ise zengin ortamda büyüyen tüm suslar arasında en düsükbiyokütle degerine sahip oldugu gözlenmistir. Minimal besi ortamında, ino1D/ino1D veslc1D/slc1D suslarının biyokütle degerleri ana susunkinden yüksek olup, inositolsüzminimal ortamda büyüyen ino1D/ino1D susu, tüm suslardan daha az miktarda hücreüreterek 1.78 g/l lik biyokütle degerine sahip olmustur. Silika tabakalar kullanılan TKanalizi ile en uygun lipid çekim yöntemi belirlenmistir. Satın alınan maya (fitosifingozinve fitoseramid) ve memeli sifingolipid standartları HPLC ile incelenmis ve kolonda kalmasüreleri ile miktar-alan iliskisine dayanan kalibrasyon egrileri elde edilmistir. Yabanıl tipsusla karsılastırıldıklarında, zengin besi ortamında büyüyen ser2D/ser2D ve inositolsüzminimal besi ortamında büyüyen ino1D/ino1D suslarında fitoseramid miktarlarında belirginbir artıs ve biyokütle degerlerinde de düsüs gözlemlenmistir. Ancak zengin ve minimalortamda büyüyen slc1/slc1 susu hem ürettigi hücre miktarı hem de dihidrosifingozin vefitosifingozin degerleriyle yabanıl tipi geçmistir. nositolsüz minimal ortamda büyüyenino1D/ino1D ve zengin ortamda büyüyen yabanıl tip suslarının kromatogramlarıincelenerek kolonda kalma süresi 13.175 dk. ve 16.772 dk. olan bilesenlerin sırasıylaMIPC ve M(IP)2C oldukları düsünülmektedir.

BY4743 parent strain and three homozygous deletion mutants, ino1D/ino1D,slc1D/slc1D and ser2D/ser2D, along with four heterozygous deletion mutants INO1/ino1D,SLC1/slc1D, LCB1/lcb1D, and LCB2/lcb2D of S. cerevisiae are investigated to improve thepresent knowledge on the synthesis mechanism of sphingolipids in yeast and to qualify aswell as to quantify sphingolipid metabolites in S. cerevisiae with an ultimate goal ofexperimental verification of potential drug targets identified by computational methods.Cells were grown in both rich and minimal media in batch cultivations. ino1D/ino1Dmutant, aside from these media, was cultivated in minimal medium without inositol. Inbatch cultivations of YPD, slc1D/slc1D mutant had overgrown the wild type andser2D/ser2D mutant had the lowest biomass value among all the strains. In F1 medium,both ino1D/ino1D and slc1D/slc1D mutants had overgrown wild type strain whileino1D/ino1D mutant grown in F1 medium without inositol had the lowest biomass value,1.78 g/l, among all the biomass values of all strains. Optimum lipid extraction procedurewas determined by TLC analysis on silica plates. Commercially available mammaliansphingolipid standards as well as phytoceramide and phytosphingosine standards obtainedfrom yeast were analyzed by HPLC to obtain their retention time values and calibrationcurves. ser2D/ser2D mutant grown in YPD and ino1D/ino1D mutant grown in F1 withoutinositol media were the strains with noticeable increases in their phytoceramide levels anddecreases in biomass values with respect to wild type strain. However, slc1/slc1 mutantgrown in YPD and F1 media had elevated dihydrosphingosine and phytosphingosine levelsas well as biomass values compared to wild type strain. Retention time values of 13.175min and 16.772 min were proposed to be representing the peaks of MIPC and M(IP)2C,respectively, by analyzing HPLC chromatograms of wild type strain grown in YPD andino1D/ino1D mutant grown in F1 without inositol media.