Bacterial uptake of antimicrobial peptides

Abstract

Beta laktam antibiyotiklerinin keşfi, bakteri kaynaklı hastalıkların tedavisinde çok önemli gelişmeler sağlamıştır. Zaman geçtikçe bazı bakteri tipleri beta laktam antibiyotiklerine karşı direnç geliştirmiş, bu durum da antibiyotiklerin etkisini önemli ölçüde azaltmıştır. En önemli direnç mekanizması bakteriler tarafından üretilen beta laktamaz enzimleridir. Antibiyotikleri beta laktamazın hidrolize edici etkilerinden korumak için sulbaktam, klavulanik asit ve tazobaktam gibi beta laktamaz inhibitörleri geliştirilmiş ve dünya çapında kullanılmaya başlanmıştır. Ne yazık ki, dirençli bakteriler farklı tipte bata laktamaz enzimleri üretmeye başlamış, bu durum da acil bir şekilde yeni inhibitörler geliştirme ihtiyacını doğurmuştur. Geliştirilecek inhibitörlerin beta laktamaz enzimlerine karşı yüksek bağlanma eğilimi göstermesi ve hücre içie etkili bir şekilde geçebilme özelliğine sahip olması gerekmektedir. Yaptığımız bu çalışmada, beta laktamaz inhibitörü olma özelliği taşıyan peptidlere, hidrofobik LLIIL kalıntısı eklenmiş, bu durumun, peptidlerin hücre içine taşınımı ve inhibite etme yetisi üzerine etkileri incelenmiştir. İnhibitör özelliği kanıtlanmış P3, ve hidrofobik kalıntılar içeren P2, P4 ve P5 kullanılarak in vitro ve in vivo deneyler yapılmış, hücre içine geçişleri, bakteri hücreleri üzerindeki etkileri ve beta laktamaz inhibite etme özellikleri incelenmiştir. Sonuçlar P2 peptidinin rekabetsiz inhibisyona neden olduğu ve K$_i$ değerinin 36$/mu$M olduğunu, P3 peptidinin ise rekabetçi inhibisyona sahip olduğunu ve K$_i$ değerinin 412.44$/mu$M olduğunu göstermiştir. P4 hem K$_m$ hem de V$_m_a_x$ değerinde kayda değer düşüşlere neden olmuş inhibisyon tipi belirlenememiştir. Hücre büyüme deneyleri de en etkili peptidein P4 olduğunu göstermiştir.

The discovery of beta lactam antibiotics has been a groundbreaking improvement in the treatment of bacterial diseases. However, most bacteria have gained resistance against beta lactam antibiotics which rendered them ineffective. Beta lactamase mediated resistance is the most frequently encountered defence mechanism. To overcome this problem, several beta lactamase inhibitors have been developed such as clavulanic acid, sulbactam and tazobactam. They are generally small molecules that pose high affinity towards beta lactamase enzyme, thus protect beta lactam from being hydrolyzed. Unfortunately, bacteria started to produce different beta lactamases which are not sensitive to conventional inhibitors that led to the emergence of designing effective beta lactamase inhibitors. These inhibitors must have high affinity as well as good cell penetration capability to inhibit beta lactamase in the periplasmic space. In this study, the effect of adding five hydrophobic residues to beta lactamase inhibitory proteins was examined. The chimeric peptides P2,P4,P5, which included a hydrophobic part and an inhibitory part, and the inhibitory peptide P3 were examined for their inhibition properties and for their cell penetration capabilities ısing in vivo and in vitro techniques. P2 showed uncompetitive inhibition with K$_i$ of 36$/mu$M and P3 indicated competitive inhibition with K$_i$ of 412.44$/mu$M. P4 decreased K$_m$ and V$_m_a_x$ around 85/%. The cell growth experiments showed that P4 was the most effective peptide that inhibited cell growth in resistant cells after 250$/mu$M.