Verification of novel Wnt/B-catenin pathway targets

Abstract

En temel sinyal iletim basamaklarından biri olan Wnt/β-catenin, omurgalılarda embriyonik gelişimi ve yetişkin homeostazisini kontrol eden evrimsel olarak korunmuş bir sinyal yolağıdır. Doku homeostazında önemli bir role sahip olan Wnt/β-catenin sinyal yolağının anormal aktivasyonu birçok çeşit kanser ile bağlantılı olup, bu yolun hedef moleküllerindeki mutasyonların tümörijenik etkiye sahip olduğu belirlenmiştir.Laboratuvarımızda yürütülen daha önceki çalışmalar BRI3 (Beyin Protein 3) ve MGAT1 (Mannosil (Alfa-1,3 -) - Glikoprotein Beta-1,2-N-Asetilglukosaminiltransferaz) genlerinin Wnt/β-katenin yolağının yeni transkripsiyonel hedefleri olduğunu doğruladı. BRI3 veya MGAT1'i stabil şekilde eksprese eden hepatosellüler kanser hücreleri Huh7'lerin, doğal fenotip Huh7 hücrelerine kıyasla daha proliferatif ve istilacı yeteneklere sahip olduğu ve deri altından NUDE/SCID farelere enjekte edildiğinde daha büyük tümör oluşumu ile sonuçlandığı görülmüştür. MGAT1 ve BRI3 genlerinin hepatoselüler kanser oluşumuna katkısını aydınlatabilmek için araştırmaları daha derine indirerek RNA-dizileme yöntemine başvurulmuştur. Çeşitli hücresel yolaklarda görev alan belirli genlerde, kontrol ve BRI3 veya MGAT1 genlerinden birinin aşırı anlatımının sağlandığı hücreler arasında diferansiyel ekspresyon seviyeleri gözlemlenmiştir. Western Blot ve qRT-PCR teknikleri kullanılarak bu diferansiyel ekspresyon seviyeleri doğrulanmıştır. Kanser oluşumunun altında yatan mekanizmayı ortaya çıkarabilmek adına protein-protein fiziksel etkileşimleri biyoinformatik olarak incelenmiş ve farklı kombinasyonlarda proteinlerarası etkileşim saptanmıştır. Literatür araştırması da dahil edilerek BRI3 ve MGAT1 genlerinin hepatosellüler kanser oluşumuna katkısı seçilen genler üzerinden incelenmiş, ve aydınlatılmaya çalışılmıştır.

One of the most fundamental signal transduction cascades, the Wnt/β-catenin signaling pathway, is an evolutionary conserved pathway in vertebrates which controls embryonic development and adult homeostasis. Signaling through secreted glycoproteins of Wnt family results in translocation of the transcriptional activator β-catenin into the nucleus where it controls key developmental gene expression programs. Having an important role in tissue homeostasis, aberrant activation of Wnt/β-catenin signaling pathway is often linked to a wide variety of cancers. Mutations in target molecules of this pathway are identified to have tumorigenic effect.Previous studies confirmed BRI3 (Brain Protein 3) and MGAT1 (Mannosyl (Alpha-1,3-)-Glycoprotein Beta-1,2-N-Acetylglucosaminyltransferase) genes to be novel transcriptional targets of Wnt/β-catenin pathway. Huh7 cells (hepatocellular cancer cell line) stably expressing either BRI3 or MGAT1 have greater proliferative and invasive capabilities compared to wildtype Huh7 cells, and when subcutaneously injected into NUDE/SCID mice resulted in larger tumor formation. In the light of these findings, tumors were subjected to RNA-Sequencing for further investigation. We observed differential expression of certain genes involved in several cellular pathways. Among these genes, we continued with YAP1, CSNK2B, and AFP in BRI3 expressing cells; and EDNRB, ADAM17, and HSPA8 in MGAT1 expressing cells. We validated differential expression levels by using Western Blot and qRT-PCR techniques. We further aim to shed light into the crosstalk between different signaling pathways involved in cancer progression.