Laktoperoksidaz enziminin sığır sütünden saflaştırılması ve bazı kinetik özelliklerinin incelenmesi

Abstract

ÖZET Laktoperoksidaz enzimi (LPO) (E.C. 1.1 1.1.7), sığır sütünden kromatografik ve biyokimyasal yöntemler kullanılarak saflaştınlmış ve bazı kinetik özellikleri araştırılmıştır. Laktoperoksidaz enziminin sığır sütünden saflaştırılması için aşağıdaki prosedürler takip edildi: Amberlite CG-50 H* reçinesiyle kısmı saflaştırma, % 0-90 doygunlukta I.amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz, CM-Sephadex C-50 iyon değişim kromatografisi, % 0-90 doygunlukta n.amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz, Sephadex G-100 jel filtrasyon kromatografisi, % 0-90 doygunlukta Ill.amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz. Enzim saflığı, sodyum dodesilsülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yöntemi ile kontrol edildi. Laktoperoksidaz enzimi, saflaştırma işlemleri sonucunda 1 litre yağı alınmış taze sütten 11,6 kat saflaştınldı ve 6,7 mg (Rz=0,7) elde edildi. Enzim saflaştırılması esnasında aktivite tayinleri için olan 2,2'-azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sülfonik asit) (ABTS) substratı (S4i2nm = 32400 M-1 cm`1) kullamldı. Substrat olarak ; p-fenilendiamin, ABTS, epinefrin, pirogallol ve katekol seçildi. Optimum pH değerleri p-fenilendiamin ve katekol için 7,5 ; ABTS için 6,0 ; pirogallol için 6,8 ve epinefrin için 8 olarak bulundu. Optimum sıcaklık değerleri; p-fenilendiamin için 45°C, ABTS için 42°C, epinefrin için 50°C, pirogallol için 60°C ve katekol için 45°C olarak bulundu. Optimum pH ve 20°C'da substratlann Km değerleri, p-fenilendiamin, ABTS, epinefrin, pirogallol ve katekol substratlan için sırasıyla; 0,197mM, 0,063 mM, 0,64 mM, 25,2 mM ve 63,95 mM olarak bulundu. p-Fenilendiamin, ABTS, epinefrin, pirogallol ve katekol substratlan için Vmax değeri sırasıyla; 3,5xl0`5 EU/ml, 4,0xl0`5 EU/ml, 5,8x10^* EU/ml, 8,4x1ü-4 EU/ml ve l,01xl0'3 EU/ml olarak bulundu.

11 SUMMARY Lactoperoxidase enzyme (LPO)(E.C. 1.1 1.1.7), from bovine milk,.` was purified by chromatographic and biochemical techniques and its kinetic features were investigated. The following steps were applied for the purification of lactoperoxidase enzyme: partial purification with Amberlite CG-50 H* resine, I.ammonium sulfate precipitation by using 0-90 % saturated ammonium sulfate and dialysis, CM-Sephadex C-50 ion-exchange chromatography, Il.ammonium sulfate precipitation by using 0-90 % saturated ammonium sulfate and dialysis, Sephadex G-100 jel filtration chromatography, Il.ammonium sulfate precipitation by using 0-90 % saturated ammonium sulfate, and dialysis. Enzyme purity was controlled with sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Lactoperoxidase enzyme was purified 11.6 times from 1 liter defatted milk and 6.7 mg of enzyme was obtained. 2,2'-azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sulfonik asit) (ABTS) substrate (E4i2nm = 32400 M*1 cm`1) was used for the enzyme activity assays during enzyme purification i processes; As substrates, p-phenylendiamine, ABTS, epinefrin, pyrogallol, and catechol were choosen. The values of optimum pH were 7.5 for p-phenylendiamine and catechol, 6.0 for ABTS, 6.8 for pyrogallol, and 8.0 for epinefrin. The values of optimum temperature were 45°C for p- phenylendiamine, 42°C for ABTS, 50°C for epinefrin, 60°C for pyrogallol, and 45°C for catechol. Km values at optimum pH and 20°C were 0.197mM, 0.063 mM, 0.64 mM, 25.2 mM ve 63.95 mM for p-phenylendiamine, ABTS, epinefrin, pyrogallol, and catechol, respectively. Vmax values at optimum pH and 20°C were 3.5xl0`5 EU/ml, 4.0xl0`5 EU/ml, 5.8X10`4 EU/ml, 8.4x10^* EU/ml ve l.OlxlO`3 EU/ml for p-phenylendiamine, ABTS, epinefrin, pyrogallol, and catechol, respectively.