İmmobilize edilmiş proteazlarda düşük su içeren organik ortamlarda peptid sentezi

Abstract

ÖZET Bu çalışmada CNBr ile aktive edilmiş Sepharose CL-6B'de kovalent bağlanma, Amberlite IRA-900 reçinesinde iyonik bağlanma ve Naylon-6, Alümina ve Bentonit'te ^djoj^sjysm__yöntemleri ile tripsin enziminin immobilizasyonlan gerçekleştirildi. Her immobilizasyon sonunda Lowry Yöntemine göre protein tayini yapılarak Alümina'ya immobilize edilen tripsinin, amaçlanan peptidasyon reaksiyonları için uygun olduğu tesbit edildi. Ayrıca, herbir aşamada tripsinin aktivitesi tayini spektrofotometrik metod kullanılarak yapıldı ve tripsin varlığında Benzoil arginin (BA) ve Lösin amid (Leu-NKfe) arasında peptidleşme reaksiyonları gerçekleştirildi. Optimum pH ve optimum sıcaklık çalışmaları yapıldı ve sırası ile pH:7 ve 25°C olarak bulundu. Su içeriği çalışıldı ve enzim için ortamın optimum su içeriğinin % 5 olduğu belirlendi. Çözücü cinsinin belirlenmesi amacıyla yapılan denemelerde BA ve Leu-NIVnin asetonitril(ACN), tetrahidrofuran (THF) veya izo amilalkolle reaksiyonların değişik şekillerde gerçekleştiği gözlendi ve deneylerde asetonitril kullanıldı. Zamanın enzim aktivitesine etkisini belirlemek amacıyla substrat olarak BA ve Leu-NHî kullanılarak 15 ay süreyle aktivite denemeleri yapıldı. Aynı substratlar için tripsine ait Km ve Vmax değerleri sırası ile 2.5xl0`3 M ve 3.35 mM/saat olarak hesaplandı. Ürün analizleri İnce tabaka kromatografisi (TLC), Yüksek Performans Likid Kromatografisi(HPLC) ve İnfrared(IR) ve Kütle(Mass) spektrofotometresi kullanılarak yapılmıştır.

n ABSTRACT In this study, the covalent attachment on the Sepharose CL-6B activated by CNBr, the ionic attachment in the Amberlite IRA-900 resin, and the immobilizations of trypsin enzyme on Nylon-6, Alumin and Bentonite were performed by the adsorption methods. It was determined that trypsin immobilized onto Alumin was suitable for the peptidation reactions aimed by determining protein according to the Lowry method at the end of each immobilization. In addition, the determination of the trypsin activity on each stage was carried out by using the spectrophotometric method, and the peptidation reactions between Benzoyl arginine(BA) and Leucin amide(Leu-NH2) were realized in the presence of trypsin. The studies for optimum pH and optimum temperature were carried out, and it was found as pH:7 and 25°C, respectively. The water content was studied, and it was determined that optimum water content of medium was 5% for trypsin. It was observed that reactions of BA and Leu-NHî with acetonitryl, tetrahydrophuran and iso amylalcohol were realized in the different states in the experiments for the purpose of the determination of solvent kind. The activity experiments were carried out by using BA and Leu-Ntt as the substrate for the purpose of the determination of the effect of time on the trypsin activity within 15 months. The values of Km and Vmax were calculated as 2.5xl0`3 M and 3.35 mM/h with respect to trypsin for the same substrates. The product analysis were carried out by using the Thin-layer, High Performance Liquid Chromatography, IR and Mass Spectrophotometers.