Yeni enzim polimer konjugatlarına dayalı glukoz biyosensörü hazırlanması ve uygulamaları

Abstract

Enzimler tıpta, biyoteknoloji ve endüstrinin çeşitli alanlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu uygulama alanlarında, enzimlerin sıcaklığa, pH'ya ve diğer çevre koşullarına karşı dirençli olması istenmektedir. Bu nedenle, enzim moleküllerinin özelliklerini değiştirmeye yönelik genetik ve kimyasal modifikasyonlar ile ilgili araştırmalar önem kazanmıştır. Enzimler suda çözünür polimerler ve ya bazı kimyasal maddeler kullanılarak modifiye edilebilmektedir. Bu şekilde üretilen, optimum sıcaklığı ve pH aralığı farklı, ortamda bulunan kimyasal maddelere dirençli modifiye enzimler çeşitli uygulamalarda yararlı olmaktadır. Doğal ve sentetik makromoleküllerin enzimler ile oluşturduğu konjugatlar tıpta ve biyoteknolojinin çeşitli dallarında kapsamlı uygulama alanları bulmaktadır.Glukoz oksidaz (β-D-glukoz:oksijen 1-oksidoreedüktaz , EC 1.1.3.4), β-D-glukoz ile hidrojen peroksid arasında gerçekleşen ve sonuçta D-glukono-δ-lakton oluşum reaksiyonunu katalizleyen flavoprotein yapısında ticari bir enzimdir. Bu reaksiyonda elektron alıcı olarak moleküler oksijen kullanılmaktadır. Her bir GOD alt ünitesi kofaktör olarak, bağlı olmayan ve gevşek bir biçimde yapıda bulunan bir mol flavin adenin dinükleotid (FAD) içermektedir.Bu çalışmada termal stabilitesi yüksek olan Glukoz Oksidaz (GOD) - Polietilen glikol (PEG) kovalent konjugatları sentezlendi. Öncelikle, polietilen glikolün (PEG) aldehid türevi sentezlendi ve GOD enzimi ile farklı mol oranlarında (nGOD/nPEG: 1/1, 1/5, 1/10, 1/20) enzim-polimer konjugatları sentezlendi. Elde edilen enzim-polimer konjugatları dört dedektörlü HPLC sisteminde (GPC) ve FTIR spektroskopisi yöntemiyle incelendi.Sentezlenen konjugatların ve serbest enzimin farklı sıcaklıklarda ve farklı pH değerlerindeki aktiviteleri tayin edildi ve sonuçlar kıyaslandı. Konjugatlar, tüm sıcaklık ve pH değerlerinde serbest enzimden daha düşük aktivite gösterdi. Ancak yüksek sıcaklığa karşı oldukça iyi direnç göstererek serbest enzimden daha yüksek aktivite değerleri izlendi. Konjugatın zamana bağlı termal stabilitesinin oldukça iyi olduğu gözlendi. Ayrıca, GOD-PEG konjugatının tayin edilen raf ömürlerinin, serbest enzimden daha iyi olduğu görüldü.Bu tez çalışmasında, Prof.Dr. İbrahim Işıldak tarafından Biyomühendislik laboratuvarlarında geliştirilen mikro boyutlarda kompozit pH duyarlı sensör kullanılarak glukoz duyarlı potansiyometrik biyosensör geliştirilmesi hedeflenmiştir. Biyosensörün hazırlanmasında enzim, kompozit pH sensör membran yüzeyine veya içine immobilize edildi. Hazırlanan glukoz duyarlı biyosensör iç referans elektrot ve iç referans çözelti içermemektedir. Uzun sure kararlı okuma yapabileceği ve sürekli ölçüm sistemlerinde kullanılmaya elverişli olabileceği düşünülen biyosensörün potansiyometrik performansı bilgisayar kontrollü ölçüm sistemi ile izlendi.

Enzymes are widely used in medicine, many fields of biotechnology and industry. In these fields, enzymes being stable against high temperature, pH and other media conditions are desired. For this reason, genetical and chemical modifications for the alteration of enzyme molecule characteristics are gained considerable importance. Enzymes can be modified chemically by using water-soluble polymers or some chemicals. Modified enzymes, produced by this way, whose optimum pH range and optimum temperature is changed and also stable against chemicals found in media, are advantageous for various applications. Conjugates of natural and synthetic macromolecules with enzymes provides wide usage in medicine and in many fields of biotechnology. The commercial enzyme, Glucose oxidase (β-D-glucose: oxygen 1-oxidoreductase, EC 1.1.3.4) is flavoprotein structured enzyme catalyzing a reaction between β-D-glucose and hydrogen peroxide and generating D-glucono-δ-lactone as a product. In this reaction molecular oxygen is used as an electron acceptor. Each GOX subunit contains one mole of flavin adenine dinucleotide (FAD) as cofactor which is not covalently bonded and loosely found in the structure. In this study, Glucose Oxidase (GOD) - polyethylene glycol (PEG) covalent conjugates were synthesized whose resistance was increased against high temperature. Firstly polyethylene glycol aldehyde derivative was synthesized and enzyme-polymer conjugates with different molar ratios (nGOD/nPEG: 1/1, 1/5, 1/10, 1/20) were synthesized using enzyme (GOD). The obtained conjugates were examined with GPC system and FTIR spectroscopy. Activities of synthesized conjugates and free enzyme at different temperatures and pH values are determined and results are compared. The conjugates showed lower activity compared to purified enzyme in all temperatures and pHs. However, the conjugates against increasing temperatures showed greater activity values when it is compared to free enzyme. The conjugate displayed quite well thermal stability against high temperatures. Storage stability of GOD-PEG conjugate was also studied and showed better stability than free enzyme.In this thesis study, the development of a glucose sensitive biosensor has been purposed by using micro sized potentiometric pH sensitive composite membrane sensor first time produced in Bioengineering's laboratories by the Prof.Dr. İbrahim Işıldak. The enzyme is be used to immobilize for composite pH sensor membrane surface or inside while biosensor is being prepared. The glucose-sensitive biosensor is not include inner reference electrode and inner reference solution. The biosensor is thought to be more suitable to make stable readings for a long time and to be used for continuous measurement systems. Potentiometric performance of biosensor will be examined with a computer-contolled measurement system designated.