An investigation of sleep-active neurons using pharmacogenetic methods

Abstract

Uykunun sinirsel mekanizması hakkında çok az bilgi mevcuttur. Bu nedenle, bu tezde memeli beyninde uyku ve uyanıklık durumlarını kontrol eden nörotransmiter ve sinirsel devrelerin işleyişlerinin daha iyi anlaşılabilmesi için çalışmalar yürütülmüştür.Bu konuda şu an için varolan temel hipotez, flip-flop modeli, uykuda aktif olan GABA-erjik sinir hücrelerinin uyku süresince uyarıcı sinir hücrelerini inhibe ettiğini öne sürmektedir. Bu hipotezi test etmek için, uykuda aktif sinir hücreleri seçici ve geri döndürülebilir bir şekilde aktive veya inhibe edilmiştir. Bu amaçla, ikili genetik açma-kapama sistemi oluşturulmuştur; sistemde sinirsel aktivite ile indüklenen ve bir transkripsiyon aktivatörünü kodlayan gen (TET-aktivatör okuma çerçevesine bağlı c-fos promotoru) ve G-proteini reseptörleri olan hM3Dq veya hM4Di'nin okuma çerçevesine bağlanmış TET protein bağlanma bölgesini kodlayan gen bulunmaktadır. Bu iki transgen sistemi rekombinant adeno-ilişkili virüs (AAV) içine paketlenmiştir ve stereotaksik enjeksiyon ile beynin uyku aktif VLPO bölgesine iletilmiştir. İlk transgen sisteminin ikinci transgen sisteminin ekspresyonunu in vivo olarak tetiklemesi planlanmıştır. hM3Dq ve hM4Di reseptörleri, normalde vücutta herhangi bir hedefi olmayan klozapin-N-okside (CNO) adlı ilaca yanıt verirler. CNO'nun hM3Dq reseptörlerine bağlanması bu reseptörü taşıyan hücrelerde uyarılmaya neden olurken; hM4Di reseptörünün CNO kökenli aktivasyonu inhibisyonu tetiklemiştir.EEG ölçümleri ve hayvan davranış testleri yaparak, CNO uygulamasının uyku üzerindeki etkileri uykusuz bırakılmış farelerde incelenmiştir. VLPO'daki uyku-aktif nöronların seçici bir şekilde uyarılması, flip-flop modelinin önerdiği gibi, farelerde uykuyu tetiklemiştir.

There is little known about the neural mechanisms governing how we sleep. In this thesis we were interested in understanding the neurotransmitters and the neural circuitry that are used in the mammalian brain to control sleep and the waking state.The current major hypothesis, flip-flop model, is that sleep-active GABAergic neurons inhibit arousal neurons throughout the sleep period. To test this hypothesis, sleep-active neurons have been excited or inhibited selectively and reversibly. A binary genetic switch have been constructed; a neuronal activity-inducible gene encoding a transcriptional activator (c-fos promoter linked to TET-activator reading frame) and a gene that encodes the TET protein binding site linked to a reading frame for the G-protein coupled receptors hM3Dq or hM4Di. These two transgene system have been packaged into recombinant adeno-associated viruses (AAV) and delivered into sleep active VLPO region of the brain by stereotaxic injection. It was planned the first transgenic system to drive the second one, in vivo. hM3Dq and hM4Di receptors respond to the drug clozapine-N-oxide (CNO), which usually has no targets in the body. CNO administration produced excitation in sleep-active neurons which express the hM3Dq receptor; conversely, hM4Di activation expected to produce inhibition.Using EEG recordings and animal behavior test, effects of CNO administration has been investigated upon sleep in sleep-deprived mice. It has been understood that selectively excited sleep-active neurons in VLPO have been able to induce sleep when the animals were wake as flip-flop hypothesis proposed.