Endüstriyel olarak kullanılabilecek lipazları kodlayan genlerin zeytinden klonlanması

Abstract

Lipazlar, triglisertilerin hidrolizini katalizleyen hidrolazlardır. Hidroliz dışında esterleşme, ester değişimi, asidoliz, alkoliz, aminoliz gibi sentez reaksiyonlarını katalizleyebilen çok yönlü enzimlerdir. Bölge seçicilik, enantiyoseçilik ve stereoseçicilikleri ve yüksek stabiliteleri nedeniyle sayesinde organik kimyada, deterjan, ilaç, gıda, kozmetik, kâğıt, deri endüstrilerinde, biyodizel üretiminde kullanılırlar.Endüstride çoğunlukla mikrobiyal lipazlar kullanılmaktadır. Bitkisel lipazlarla ilgili az sayıda çalışma mevcuttur. Bitki lipazları genelde yüksek substrat özgüllüğü gösterirler. Bitki lipazları ile ilgili literatürdeki bilgilerin çoğu yağlı tohumlarla ilgilidir. Yağlı tohumlarda aktif lipazlar genellikle çimlenen tohumlarda bulunmuştur. Bunula beraber hint yağı lipazı gibi bazı lipazlar dormant tohumda aktif olarak bulunmuştur. Bunun dışında lateks lipazları da kullanım alan ve olanakları ile dikkat çekmektedir.Bu projede zeytinden lipaz enzimlerini kodlayan genlerin klonlanması amaçlanmaktadır. Bu amaçla RACE yöntemi kullanılmıştır. Öncelikle farklı bitkisel lipaz homologlarının dizileri kullanılarak EST veritabanı taranmış ve lipaza benzerlik gösteren 843 bp uzunluğunda bir zeytin contig dizisi bulunmuştur. Bu dizi kullanılarak 3'RACE primerleri tasarlanmış ve cDNA'nın 3' ucu çoğaltılmıştır. Daha sonra 5'RACE yöntemi ile cDNA'nın 5' ucu çoğaltılmıştır. Daha sonra RACE ile edle edilen dizi bilgisi kullanılarak tasarlanan primerler ile 1536 bp uzunluğundaki cDNA tek dizi olarak klonlanmıştır. Bu dizinin lipaza benzerliği BLAST programları ile doğrulanmıştır. Zeytin yaprak lipazının GXSXG lipaz ailesine dahil olduğu görülmüştür. Gerçek Zamanlı PZR analizleri soğuk stresinin ilk 24 saattinde lipaz relatif ekspresyon düzeyinin stres verilmemiş örneğe göre azaldığını göstermektedir. Onuncu günde ise ekpresyon düzeyi stres uygulanmamış örneklerdeki ekspresyon düzeyinin üzerine çıkmıştır. Pichia pastoris'te heterolog ekspresyon için farklı kouşullarda ekspres denemeleri yapılmıştır. Yapılan aktivite deneylerinde enzimin pH 7'de çalıştığı belirlenmiştir. Optimizasyon çalışmları sonunda tutarlı bir ekspresyon sağlanamamıştır.

Lipases are hydrolases which catalyse hydrolysis of tri-glycerides. Lipases are versatile because they can perform both hydrolysis ve synthesis reactions like esterification, interesterification, acidolysis, alcoholysis, amylosis. Since they are chemo-selective, regio-selective, enantio-selective ve highly stable they have applications in organic synthesis, food, detergent, cosmetics, paper, pharmacological industries ve biodiesel production.Most of lipases used in industry are microbial lipases. There is only a few studies on plant lipases. Plant lipases generally exhibit a particular specificity, usually a substrate specificity. Most of the literature on plant lipases concerns about oil seed lipases. Oil seed lipases generally are active in germinating seeds. However there are lipases found active in dormant seeds, like castor bean lipase.The aim of this project is cloning of genes encoding lipase enzymes from olive leaves. For this purpose RACE method is used. First, the EST database was screened using sequences of different plant lipase homologs ve an 843 bp long olive contig sequence which is similar to lipase was found. Using this sequence, 3'RACE primers were designed ve the 3' end of the cDNA was replicated. The 5' end of the cDNA was then amplified by the 5'RACE method. New primers were designed using RACE sequence information ve an 1536 bp long cDNA was cloned as a single sequence. This sequence was analysed ve characterized with bioinformatics programs. Olive leaf lipase was found to be included in the GXSXG lipase family. Real-time PCR analyzes showed that the reletive expression level of lipase in first 24 hours exposed to cold stress were lower than no-stressed sample. Expression level in 10th day reached over no-stressed sample. Expression experiments have been conducted in different conditions for heterologous expression in Pichia pastoris. In the activity experiments, it was determined that the enzyme works at pH 7. No consistent expression was achieved by optimization studies.