1,3-propandiol`ün üretiminde farklı immobilize kültür sistemlerinin karşılaştırılmalı incelenmesi

Abstract

Hücre immobilizasyonu endüstriyel ürünlerin eldesinde sıkça kullanılan biyoteknolojik bir tekniktir. Son yıllarda bu teknik 1,3-Propandiol (1,3-PDO) gibi katma değeri yüksek ürünlerin eldesinde de kullanılmaya başlanmıştır. 1,3-PDO üretiminde mikroorganizmaların gliserolden anaerobik fermantasyonunun kullanılması, şu an mevcut olan ısıl kimyasal 1,3-PDO üretim tekniklerine çok iyi bir alternatiftir. Bunun sebepleri; yüksek hacimsel verimlere ulaşılabilmesi, daha az enerji kullanılması ve düşük miktarda çevreye zararlı atıklar açığa çıkmasıdır. Bunlara ek olarak, biyodizel üretimi sırasında yağların transesterifikasyonundan elde edilen ana yan ürün olan gliserol gibi yenilenebilir kaynakların kullanımına da olanak sağlanmaktadır. Literatürde kesikli, kesikli beslemeli, sürekli beslemeli ve iki aşamalı sürekli beslemeli sistemler ile bu üretim denemeleri gerçekleştirilmiştir. Bahsedilen denemelerden farklı olarak bu tez çalışmasında, hücre immobilizasyon yöntemlerinin 1,3-PDO üretimini önemli miktarda arttırabildiği ve daha küçük biyoreaktörlerde dayanıklı ve sürekli üretimlerin gerçekleştirilebileceği başarılı bir şekilde gösterilmiştir. Hapsetme ve tutundurmayı içeren iki farklı immobilizasyon yöntemi Klebsiella pneumoniae (GenBank No: 27F HM063413) kullanılarak sürekli kültürlerde yukarı akışlı dolgu kolon biyoreaktörlerde denenmiştir. İki yöntem de yüksek üretim verimliliklerine ulaşmış olmasına rağmen tutundurma yönteminin daha başarılı olduğu sonucuna varılmıştır. Bu tez çalışması Clostridium butyricum 5521'in proteomu incelenerek daha çok detaylandırılmış, böylece düşük ve yüksek giriş gliserol konsantrasyonu içeren fermantasyon ortamlarında farklı büyüme fazlarında gerçekleşen metabolik düzenlemeler ile ilgili bilgi sahibi olunması amaçlanmıştır. 1D, 2D ve MRM'i içeren LC-MS-MS bazlı nicel proteomik analizler farklı ifade edilen proteinleri inceleyebilmek için kullanılmıştır. Sonuçlar yüksek gliserol konsantrasyonunun büyümeyi yavaşlattığını ve çeşitli yan ürünlerin oluşmasını sağlayan metabolik yolaklardaki önemli proteinlerin ifadelerini de azalttığını göstermiştir. Bu tez çalışması gliserolden 1,3-PDO'ya giden metabolik yolaklarda görevli kilit enzimler hakkında önemli bilgiler sunmaktadır. Elde edilen bu veriler genetik manipülasyonlar ve suş geliştirme yöntemleri ile birleştirilerek daha verimli 1,3-PDO üretimleri için özgün stratejiler geliştirilmesinde kaynak olarak kullanılabilecektir.

Cell immobilization is a biotechnologicial tecnique often used for industrial production of high-value products. In recent years, immobilization techniques have been applied to production of value-added chemicals such as 1,3-Propanediol (1,3-PDO). Biotechnological fermentation of anaerobic bacteria using glycerol is an attractive alternative to current 1,3-PDO production methods, which are primarily thermochemical processes, because it generates high volumetric yields of 1,3-PDO, is a much less energy intensive process, and generates lower amounts of environmental organic pollutants. In addition, renewable resources, such as glycerol being the main by-product of trans esterification of fats in the biodiesel production can be used as a substrate during this production. Although several approaches including batch, fed-batch, continuous-feed, and two-step continuous-feed were tested in suspended systems in literature, in this thesis, it has been well demonstrated that cell immobilization techniques can significantly enhance 1,3-PDO production and allow robust continuous production in smaller bioreactors. Two different immobilization approaches including attachment and entrapment, were tested by continuous cultures of Klebsiella pneumoniae (GenBank No: 27F HM063413) in up flow packed bed column bioreactors. Although both methods lead to higher productivities than suspended culture, attachment of cells were reported to be more successful. This thesis was furthermore detailed by the investigation of the proteome of Clostridium butyricum 5521 in order to gain insight into the metabolic regulations during two growth phases of 1,3-PDO synthesis in medium containing low and high initial glycerol concentrations. Three different quantitative LC-MS-MS proteomic analyses including 1D, 2D and MRM, were conducted to identify differentially expressed proteins. The results showed that high glycerol concentration slowed down growth and lowered the expressions of some key proteins that are important in the metabolic pathways leading to various end-products. This thesis provides insight into the key enzymes and metabolic pathways involved in the synthesis of 1,3-PDO from glycerol, and these data may be used to facilitate the development of novel strategies for a more efficient synthesis of 1,3-PDO by the utilization of genetic manipulations or strain improvement.