Kronik miyolositer lösemide (KML) BCR-ABL ve ABL-BCR hibrit genlerinin RT-PCR ve southern blot yöntemi ile gösterilmesi

Abstract

6. ÖZET Bu çalışmanın amacı KML hastalarında BCR-ABL ve ABL-BCR hibrit genleri nin varlığının RT-PCR yöntemi ile gösterilmesidir. Bu tezde kronik ve blast krizde bu lunan 26 KML hastası (10 hasta Ph+, 8 hasta Ph'-, 8 variant Ph'+) çalışılmıştır. BV173 ve K562 hücre hatları pozitif kontrol olarak KGIA hücre hattı ise negatif kontrol olarak kuUanılmıştrr. Toplam RNA'lar kan, kemik iliği ve hücre soylarından izole edilerek; mRNA'lar- dan cDNA'lar sentezlenmiş ve böylece hedef DNA'lar PCR yöntemi ile çoğaltılmıştır. 26 KML hastasının BCR-ABL bileşimlerinin tesbiti için oligonükleotid primerler uy- gulanmışür. Aynca, oligonükleotid primerler ve problar, normal ABL BCR ve ABL- BCR'in RNA'lan içinde de kullanılmıştır. 5 il PCR ürünü, % 21ik agaroz jele yüklenerek mini jelde % 1 TBE tamponunda ayrılmış ve jel ethidium bromür ile boyanarak uv ışığında fotoğrafı çekilmiştir. 26 KML hastası ve 3 hücre hatlarının biri dışında (BV173) tamamında normal ABL ve BCR gen ürünleri gözlenmiştir. BV173 hücre hatunda normal 9. kromozom59 bulunmadığından alternatif ilk eksonlanndan başlayan RT-PCR'da c-ABL mRNA'sı tesbit edilememiş, buna karşılık normal BCR transkripti 22. kromozomda amplifiye edilmiştir. Tüm Ph' pozitif ve Ph' negatif hastalann 3 tanesinde BCR-ABL hibrit geninin var lığı, RT-PCR yöntemi ile gösterilmiştir. Bu sonuçlar, b2a2 ve b3a2 birleşimini tanıyan oligonükleotitlerin prob olarak kullanıldığı Southern blot yöntemi ile de desteklenmiş tir. ABL-BCR mRNA transkripti BCR-ABL pozitif ve Ph' pozitif 10 hastanın 4'de tesbit edilirken, 3 Ph' negatif/BCR-ABL pozitif ve tüm variant Ph' pozitif BCR-ABL pozitif hastalarda bulunamamıştır. îlk PCR amplifikasyonlannda ABL-BCR tesbit edi lemeyen hastalara Nested PCR uygulanarak yapılan daha ileri uygulamalarda da, pozi tif sonuçlar alınamamıştır. Sonuç olarak bu çalışmada, sitogenetik analizlerle tesbit edilemeyen Ph* negatif KML hastalarının yaklaşık yansında ve Ph' pozitif KML hastaların tamamında BCR- ABL'nın varlığı, RT-PCR yöntemi ile gösterilmiştir. Sitogenetik olarak çok zor göste rilen der 9 q+'nın varlığı ise ~ % 50 oranında tesbit edilmiştir. BCR-ABL ve ABL-BCR hibrit genlerinin protein ürünlerinin hücre içi fonksiyon ları ve hangi yolları kullanarak hücreleri transforme ettiğinin anlaşılabilmesi için de daha ileri araştırmalara gerek duyulmaktadır.

7. SUMMARY In this research; the presence of BCR-ABL and ABL-BCR mRNAs were detected by the Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) in CML patients. Also, cell lines BV173 and K562 as positive controls and KG1A as a negative control were used in this study. Total RNA were extracted from peripheral blood, bone morrow and cell line cont rols and their cDNA's were synthesised. Enzymatic amplification was performed by the polymerase chain reaction (PCR). Oligonucleotide primers synthesised to know BCR- ABL junctions were applied to cells from 26 patients and control cell lines. In addition, oligonucleotide primers and hybridisation probes to amplify and detect normal ABL, BCR and ABL-BCR mRNAs were also synthesised. 5 il of PCR product were fractio nated on 2 % agarose minigels in 1 % TBE buffer. Gels were stained with ethidium bromide and photographed under the UV light. All 26 patients and the 3 cell lines gave amplification products for normal ABL and BCR genes. The one exception was the cell line BV173 in which chromosome 9 is61 absent, hence no ABL mRNA transcript was detected. However, a normal BCR trans cript was amplified from chromosome BCR-ABL mRNA transcripts were detected by RT-PCR in all 10 Ph'+ and all 8 Ph'+ variants and 3 Ph'- patients. These results were subsequently confirmed by Southern blotting with oligonucleotide probes specific for the b2a2 and b3a2 junctions. The reciprocal ABL-BCR mRNA transcript was detected in 4 of 10 of BCR- ABL+, Ph'+ patients. No ABL-BCR transcripts were found in the 3 Ph'- and/ BCR- ABL+ patients in the BCR-ABL+ and variant Ph'+. Further amplification with nested primers failed to give subsequent results. The presence of BCR-ABL gene which could not be detected by cytogenetic analysis, were now shown to be present in half of all Ph negative patients and all Ph' positive CML patients by RT-PCR. The function of the P210 bcr-abl ^ ABL-BCR proteins in the Ph' translocation has not been established yet It is also not known that how these two proteins could change normal cells into malignant ones. Therefore further search is necessery in the study of these transformation mechanisms.