Bakteri lipopolisakkarit alt ünitelerinin detoksifikasyonları ve bu preparatların immun advujan olarak doğal bağışıklığı tümör hücrelerine karşı uyarması

Abstract

-48- ÖZET Gram negatif bakterilerin hücre duvarlarının dış membran kısmında endotoksin (ET) adı verilen lipopolisakkarit (LPS) yapısında maddeler bulunmaktadır. Bu maddeler toksik olup aynı zamanda da bağışıklık sistemi hücrelerini uyarıcı etkiye sahiptirler. LPS molekülü toksik olduğu halde, asitle hidroliz edildiğinde düşük toksisiteli Lipid A ve nontoksik polisakkarit (PS) fraksiyonları elde edilebilmektedir. Bu fraksiyonlar da immun sistem hücrelerini uyarabilmektedirler Çalışmamızda amaç, immun sistem hücrelerinden, NK hücrelerinin in vitro ve in vivo etkilerinin, LPS ve fraksiyonları ile uyarılıp tümöre karşı etkili olup olmadıklarını ortaya çıkarmaktır. Bu nedenle çalışmada kullanılmak üzere Serratia marcescens bakterisinden LPS, `High Pressure Liquid Chromatograpy` ya da yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ile saflaştırılmış LPS, Lipid A, PS ve White tipi polisakkarit (WPS) hazırlandı ve `Lymulus Amebocyte Lysate` (LAL) testi ile toksisiteleri ölçüldü. Bu ürünlerin NK ve `Lymphokine Activated Killer` (LAK) ya da lenfokinle uyarılmış doğal sitotoksik hücreler üzerine etkileri sitotoksisite (CR51 salınımı ve antikandidiyal sitotoksisite) deneyleri yapılarak gösterildi. Çalışmanın sonraki bölümlerinde hazırladığımız bakteri ürünlerinin fareler üzerinde in vivo tümör metastazlarını değişik oranlarda azalttığı ve aynı zamanda bu ürünlerin NK hücrelerini in vivo olarak uyarması ve bu uyarının günlere göre değişimi, laboratuvarımızda geliştirilen in vitro antikandidiyal sitotoksisite deneyi ile gösterildi. Çalışmamızın doğal hücresel sitotoksisite deneylerinde standart deney olan Cr^1 salınım deneyi laboratuvarımız şartlarında çalışır duruma getirilmiş ve bu deney kullanılarak LPS'nin NK hücrelerini uyararak LAK hücreleri haline getirebildiği LAK hücrelerinin kendi hedefleri olan P815'e karşı sitotoksik aktivitesi ölçülerek gösterilmiştir. LPS' nin NK hücrelerini uyardığı, laboratuvarımızda geliştirilen antikandidiyal kolorimetrik sitotoksisite deneyleriyle de yapılarak gösterilmiştir. Daha sonra Cr51 salınım deneyi ile paralellik gösteren kolorimetrik yöntem kullanılarak, elde ettiğimiz bakteriyel ürünlerle uyarılıp uyarılmadığına bakılmıştır.-49- Araştırmamızda amaç; en etkili, fakat doz arttırımına en uygun düşük toksik etkiye sahip bir immunstimulatör veya immun adjuvan madde elde etmekti. Araştırmamızın in vivo uyarım deneyleri ile, tümör verilen farelerin bakteri ürünleri ile ne derece tedavi edilebildiği ve tümör verilmeksizin değişik bakteriyel preparatların immun sistemi günlere bağlı olarak nasıl uyardığı laboratuvarımızda geliştirilen kolorimetrik bir testle gösterilmiştir. Sonuç olarak immun adjuvan olabilecek özelliklere sahip preparatlardan PS ve WPS'nin; in vivo kullanıma uygun düşük toksik etki gösterdiği bulunmuştur. İmmun uyarıcı özelliğinin yeterince yüksek olduğu dozun ve tekrar dozlarının ayarlanması ile bu iki LPS fraksiyonu, anti- tümöral in vivo immunterapide ileri çalışmalar için umut vadetmektedir.

-50- YABANCI DİLDE ÖZET ENHANCING THE NATURAL KILLER CELL ACTIVITY AGAINST TUMOR CELLS BY USING DETOXIFIED SUBUNITS OF BACTERIAL LIPOPOLYSACCHARIDE AS IMMUNE ADJUVANTS The outer membrane of Gram negative bacteria contain lipopolysaccharides (LPS) named as endotoxins (ET). These ET molecules are known as toxic and also immuno-stimulant substances. Mild acidic hydrolysis of the ET molecule dissociates it into a less toxic Lipid A and non-toxic polysaccharide (PS) fractions. As these fractions lose most of their toxic activity by mild acidic hydrolysis, they still retain their immuno- stimulant potency. This study was aimed to show whether the LPS fractions enhance the Natural Killer (NK) cell activity against tumor cells in vitro and/or in vivo. In order to prepare the required High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) purified LPS, Lipid A, PS and White Type Lipopolysaccharide (WPS), Serratia marcescens strain was used as the source of Gram negative bacterium. Toxic activity of these products were detected by Lymulus Amebocyte Lysate (LAL) test. Some of these products that were found less toxic than others were tested for their enhancing effect onto the NK and Lymphokine Activated Killer (LAK) cells by the Cr51 release and anti-Candidial colorimetric cytotoxicity assays. The less or non-toxic fractions were studied for their in vivo tumor metastasis regression on mice that were injected with both tumor cells and these fractions. Finally, these fractions were also tested in normal mice without injecting tumor cells for their ability to stimulate the NK and LAK cell activity in vivo in a day dependent manner. The spleen lymphocyte cytotoxic activity was detected using colorimetric anti-Candidial assay at 0, 24, 48 and 96 hours after injection of the fractions. By means of this study, the conventional Cr51 release assay was standardized in our laboratory. This assay was then applied to show that the LPS could induce NK cells to LAK cells using the LAK target P815-51- in vitro. A new anti-Candidial colorimetric cytotoxicity assay that had previously been developed in our laboratory was compared with the conventional chromium release assay. We have found out that both assays were similar in testing the immuno-stimulation of Large Granular Lymphocytes (LGL); therefore, we used the colorimetric cytotoxicity assay for the rest of the study since it was more easier and cheaper than the conventional chromium release assay. Because the aim of these experiments were to find good candidate molecules that were low in toxicity and could be used in high doses to stimulate the immune response against the tumor cells efficiently. We have tried to stimulate normal and tumor bearing mice lymphocytes by injecting them the non-toxic and lowest toxic LPS fractions to find out the tumor metastases regression and day-dependent duration of immuno- stimulation effects of these products. Consequently, we have concluded that the most hopeful immune adjuvant candidates among the other LPS fractions were PS and WPS which were found as the lowest toxic ; however, similar in immuno- stimulation effect compared to the commercially available Monophosphoryl Lipid A (MPLA). This may possibly mean that PS and WPS can be used in more higher and effective doses safely without their toxic effects. We think that after further studies on dosage and booster doses of PS and WPS may be used in anti-tumoral immunotherapy in the future.