Epidermal Büyüme Faktörü(EGF)`nün gastrointestinal sistem ülserlerindeki etkisinin incelenmesi

Abstract

-142- G. ÖZET Peptitlerin molekül ağırlıklarının büyük olması, gastrointestinal bölgede çabuk parçalanmaları, barsak epitelyumundan geçişlerinin zayıf olması, ve karaciğerden ilk geçiş etkisi göstermelerinden dolayı oral yoldan verilmeleri çok sınırlıdır. Bu çalışmada, bir polipeptit olan epidermal büyüme faktörü (EGF)'nün gastrointestinal sistemdeki stabilitesini arttırmak, EGF'nün intragastrik (i.g) verilişinin etkisini incelemek ve soğuk-haraketsizlik stresi ile mide ülseri oluşturulmuş sıçanlarda akut mide ülserinin iyileşmesini sağlayacak bir mikroemülsiyon formülasyonu geliştirilmek amaçlanmıştır. Mikroemülsiyon, Labrafil M 1944 CS, Arlacel 186 ve Brij 35, mutlak alkol ve distile su, sırasıyla yağ fazı, yüzey etkin maddeler, ko-solvan (Ko-S) ve sulu faz kullanılarak hazırlandı. Mikroemülsiyonun faz ayrışması, bulanıklığı (türbiditesi), damlacıkların büyüklükleri, refraktif indeksi, dansitesi, iletkenliği, pH'sı ve viskozitesi gibi fiziksel karakteristikleri farklı sıcaklıklarda (4°C, 30°C ve 40°C) 12 ay boyunca ölçüldü. EGF'nün mikroemülsiyondaki stabilitesi de üç farklı saklama sıcaklığında (4°C, 30°C ve 40°C) üç ay süreyle araştırıldı. EGF miktarı radioimmunoassay (RIA) ile ölçüldü. EGF'nün mikroemülsiyondan in vitro salımı Franz difüzyon hücresi kullanılarak pH 1.2 mide ortamında 37±0.1°C'de yapıldı. Çalışmada 189-229 g ağırlığında dişi Wistar albino sıçanlar kullanıldı. Sıçanlarda dört saatte soğuk-hareketsizlik stresi ile akut mide lezyonları oluşturuldu. EGF günde 6 ug/kg dozda i.g. ve intraperitonal (i.p.) olarak yedi gün verildi. Bazal mide asit sekresyonu (umol H+/30 dak.), ülser skoru (mm2), mide mukus salgısı (ug/g doku), mukozal doku kolesterolü (mg/g doku), doku EGF seviyeleri (pg/ g doku), açlık pH'sı ve bazal pH ile mide ağırlığındaki değişimler tayin edildi. Bütün deney gruplarında mide mukozasındaki değişimler histolojik olarak incelendi.-143- Sonuçlar, geliştirilen mikroemülsiyonun farklı saklama koşulları altında fiziksel karakteristiklerinde değişiklik olmadığını gösterdi (p>0.05). Mikroemülsiyonun viskozitesinin saklama koşullarında az da olsa değiştiği gözlendi (p<0.01 ). Sonuçlar, iki farklı saklama koşullarında EGF'nün birinci derece kinetikle bozunduğunu göstermiştir. Arrhenius eşitliği kullanılarak sıcaklığın reaksiyon hızı üzerine etkisi değerlendirildi. Aktivasyon enerjisi (Ea) 21.7 kkal/mol olarak hesaplandı. 25°C'de EGF'nün mikroemülsiyondaki raf ömrü (tgo) 7 gün bulundu. İn vitro salım salım çalışmalarına göre, EGF'nün mikroemülsiyondan salımı altı saatte % 85 olarak bulundu. Akut mide ülserini iyileştirmek için i.g. verilen EGF içeren mikroemülsiyon formülasyonu (ME+EGF), i.g. verilen EGF çözeltisi (EGF'nün sudaki çözeltisi-İG-EGF) ve i.p. EGF (EGF'nün serum fizyolojikteki çözeltisi- İPEGF) ile karşılaştırıldı. Mide asit salgısı, EGF'nün mikroemülsiyon şeklinde verilmesinden sonra, 30 dakika sonunda anlamlı olarak azaldı (p<0.05). İPEGF grubundaki mide asit salgısı İPSF grubu ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak azalmadı (p>0.05). Bütün grupların açlık pH'ları arasında anlamlı fark bulunamadı (p>0.05). Bazal mide sıvısı pH ölçümlerinde, İPEGF grubunun pH'sı (3.06±0.72) İPSF grubunun pH'sı (1.66+0.19) ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak arttı (p<0.01). ME+EGF (p<0.05) ve İG-EGF (p<0.001) gruplarının pH'ları kendi kontrol grupları ile karşılaştırıldığında anlamlı bir şekilde arttı. Ortalama ülser alanlar i.g. uygulanan EGF'nün ME dozaj formunda yedi gün süreyle verilmesiyle 15.88±3.28 mm2'den 1.16±1.09 mm2'ye azaldı ve guruptaki sıçanların dört tanesi tamamen iyileşti, i.p. EGF uygulanan grupta (İPEGF) ise yedi gün sonunda ortalama ülser alanı 4.48±2.28'dur. Sonuçlar, ülser skorunun İPEGF (p<0.05), İG-EGF (p<0.001) ve ME+EGF (p<0.001) gruplarında, kendi kontrol gruplarına oranla anlamlı azaldığını göstermiştir.-144- İG-EGF (p<0.05) ve ME+EGF (p<0.001) mukus seviyeleri kendi kontrol grupları ile karşılaştırıldığında artmıştır. Buna karşın i.p. EGF uygulamada herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir (p>0.05). ME+EGF, İPEGF ve İG-EGF gruplarında mukozal doku kolesterol seviyeleri kendi kontrol grupları ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak artmıştır (p<0.05). Diğer yandan bütün deney gruplarında doku EGF seviyelerinde ve mide ağırlığındaki değişikliklerde anlamlı fark bulunmamıştır (p>0.05). Histolojik çalışmalara göre, EGF uygulanan gruplardan İG-EGF ve İPEGF gruplarında belirgin iyileşmenin olduğu, ME+EGF grubundaki iyleşmenin sağlıklı sıçanlardaki ile (KONTROL) benzer olduğu bulunmuştur. EGF içeren mikroemülsiyon formülasyonunun i.g. verilişinde, EGF'nün çözelti dozaj formundan ve hatta i.p. verilen EGF'nün serum fizyolojikteki çözeltisinden daha etkili olduğu sonucuna varılmıştır. Peptit yapısında bir madde olan EGF'nün oral yoldan mikroemülsiyon formülasyonu şeklinde uygulanmasının gelecekte ümit verici olacağını düşünmekteyiz.

-145- H. SUMMARY The oral administration of peptides is very limited because of their high molecular weight, rapid degradation in gastrointestinal tract, the poor absorption through the intestinal epithelial and the first past effect in the liver. It was aimed to develop a microemulsion formulation that will increase the stability of epidermal growth factor (EGF) which is a polypeptide in gastrointestinal system and to examine the effect of intragastric (i.g.) administration of EGF and to provide healing in acute gastric ulcers induced by cold restraint stress in rats in this study. The microemulsions were prepared by using Labrafil M 1944 CS, Arlacel 186 and Brij 35, absolute alcohol and distilled water as oil phase, surfactants, co-surfactant and aqueous phase, respectively. The physical characteristics such as phase separation, turbidity, droplet size, refractive index, density, conductivity, pH and viscosity of microemulsions were measured at different temperatures (4°C, 30°C and 40°C) during 12 months. The stability of EGF in microemulsion was also investigated at three different storage temperatures (4°C, 30°C and 40°C) for three months. Amounts of EGF were measured by radioimmunoassay (RIA). The in vitro release of EGF from microemulsion was carried out using Franz diffusion cell in pH 1.2 gastric medium at 37±0.1°C. Female Wistar albino rats weighing 189-229 g were used throughout the study. Acute gastric lesions were induced by cold restraint stress for 4 hr in rats. EGF were administered at a dose of 6 ug/kg.day`1 as i.g. and intraperitonally (i.p.) for seven days. Basal gastric acid secretion (umol H+/30 min.), ulcer score (mm2), gastric mucus amount (ug/g tissue), mucosal tissue cholesterol (mg/g tissue), tissue EGF levels (pg/g tissue), chymus pH, basal pH and change in weight of stomach were determined. The change in the mucosa of stomach were examined histologically in all experimental animal groups.-146- The results indicated that the physical characteristics of the developed microemulsion did not change under different storage temperatures (p>0.05). It was observed that the viscosity of microemulsion changed slightly with time at storage temperatures (p<0.01). The results indicate that EGF degrades via first order kinetics at two different storage conditions. The effect of temperature on reaction rate was evaluated using the Arrhenius equation. The activation energy (Ea) was calculated as 21.7 kcal/mole. The shelf life (tgo) of EGF in microemulsions was found to be 7 days at 25°C. According to the in vitro release study, the release of EGF from microemulsion was found as 85 % within 6 hr. Intragastric administration of EGF microemulsion (ME+EGF) group) formulation was compared to i.g. EGF (EGF in aqueous solution-IG-EGF group) and i.p. EGF (EGF dissolved in physiologic saline-IPEGF) to heal acute gastric ulcers. Gastric acid secretion was reduced significantly within 30 min. after administration of EGF microemulsion (p< 0.05). There were not significant decrease in gastric acid secretion of the IPEGF group when compared with IPPS group (p>0.05). There were not significant differences in the first measurement of pH in chymus for all groups (p>0.05). In second pH measurement, IPEGF group's pH (3.06±0.72) increased significantly compared to IPPS (intraperitonal physiologic saline) group's pH (1.66±0.19) (p<0.01). In the ME+EGF (p<0.05) and IGEGF (p<0.001) groups i.g. pH increased significantly compared to controls. The mean ulcer area was reduced by the treatment of i.g. ME dosage form of EGF in seven days from 15.88±3.28 mm2 to 1.16±1.09 mm2 and healed almost completely in four of animals. However, the mean ulcer area was 4.48±2.28 mm2 in the group treated with EGF for seven days by i.p. administration.-147- The results indicated that, the ulcer score reduced significantly by IPEGF (p<0.05), IG-EGF (p<0.001) and ME+EGF (p<0.001) treated groups compared to untreated groups. In the IG-EGF (p<0.05) and ME+EGF (p<0.001) groups mucus levels were increased remarkably compared to their control groups. In contrast, there was not observe any significant change in mucus levels by i.p. EGF treatment (p>0.05). The mucosal tissue cholesterol levels increased significantly in ME+EGF, IPEGF and IGEGF groups compared to their controls groups (p<0.05). On the other hand there were not significant difference in tissue EGF levels and weight changes of stomach in all experimental groups (p>0.05). According to the histological studies, on EGF administered groups it was found out that a considerable heal occurred in IG-EGF and IPEGF groups, and the heal in ME+EGF groups were similar to that of healthy rats (CONTROL). It was concluded that i.g. EGF administration in the microemulsion formulation is effective than EGF solution in water and also it is more effective than i.p. EGF solution in physiologic saline.