Lokal anesteziklerin antioksidan aktivitelerinin kemilüminans yöntemiyle araştırılması

Abstract

Bazı lokal anesteziklerin lökosit fonksiyonlarını etkilediği ve lizozomal enzim salıverilmesini inhibe ettiği bilinmektedir. Bu çalışmada lokal anesteziklerin uyarılmış insan lökositleri ya da hücresiz sistemlerde oluşturulan reaktif oksijen veya nitrojen türlerini inhibe etme gücü luminol yada lusigenin kemilüminesansı (KL) kullanılarak kimyasal ya da enzimatik olarak araştırılmıştır. Dekstran ile sedimentasyon yapılmış sitratlı insan venöz kanından lökositler izole edilmiştir. Serbest radikal oluşumunu belirlemek için bir luminometre kullanılmıştır. Reaksiyon karışımı 37°C 'de 106 hücre mL`1, luminol ve uyaran (formil-metiyonil-lösin-fenilalanin=FMLP, 2 uJVI) içeriyordu. Hücresiz deneylerde hidrojen peroksit (H2O2), hipokloröz asit (HOCİ), hidroksil radikali, peroksinitrit ve ksantin-ksantin oksidazın luminol ve/veya lusigenin KL'ları 3.5 mM H202, 5 uM sodyum hipoklorit, 40 nM FeS04, 50.nM peroksinitrit ve 0.1 mmol/L ksantin ile 0.2 U/mL ksantin oksidaz ile oluşturulmuştur. Lokal anesteziklerin etkileri stimülan eklenmeden hemen önce uygulanarak araştırıldı. Pik KL ölçümünden sonra lokal anesteziklerin etkileri tek başına stimülanla oluşan yanıt ile karşılaştırılarak % değişim olarak gösterilmiştir.54- Yapılan deneylerde lokal anesteziklerden lidokain, prilokain, bupivakain ve tetrakainin izole lökositlerde FMLP ile oluşturulan KL'si belirgin şekilde konsantrasyon bağımlı olarak inhibe ederken, artikainin ise yüksek konsantrasyonda aktive ettiği gösterildi. Hücresiz deneylerde ise kullanılan tüm lokal anesteziklerin ksantin-ksantin oksidazla oluşturulan KL sinyallerini belirgin şekilde konsantrasyon bağımlı olarak inhibe ettiği gösterildi. Ancak, lidokain, bupivakain ve tetrakain hidrojen peroksitle oluşturulan luminol KL' sinin konsantrasyon bağımlı şekilde aktive ederken, prilokainin inhibe ettiği, artikainin ise etkilemediği bulundu. Ayrıca prilokain, artikain ve tetrakainin hidrojen peroksitle oluşturulan lusigenin KL'sini konsantrasyon bağımlı inhibe ettiği gösterildi. Demir sülfatla oluşturulan KL sadece tetrakain ile konsantrasyon bağımlı olarak inhibe edildi. Kullanılan lokal anesteziklerin hepsi hipokloröz asitle oluşturulan kemilüminesansı konsantrasyon bağımlı şekilde inhibe etti. Prilokain hariç diğer lokal anestezikler peroksinitritle oluşturulan luminol KL'sini, prilokain ve bupivakain hariç diğerleri ise peroksinitiritin oluşturduğu lusigenin KL'sini konsantrasyon bağımlı inhibe ettiği bulundu. Bu çalışmanın sonucunda lokal anesteziklerin serbest radikaller ve metabolitlerinin büyük bir çoğunluğuyla direkt olarak etkileşmekte olduğu ve bu etkileşmenin lökositlerde görülen inhibisyondan da sorumlu olabilecekleri sonucuna varılmıştır. Bu sonuçlar lokal anesteziklerin kimyasal yapıları gözönüne alınarak antioksidan aktivitesi olan moleküllerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir.

Some of the local anesthetics are known to impair leukocyte functions and inhibit lysosomal enzyme release. The ability of local anesthetics to inhibit reactive oxygen and nitrogen species generated by stimulated human leukocytes or cell-free systems either chemically or enzymatically was investigated by using luminol- and lucigenin-enhanced chemiluminescence (CL). Leukocytes were isolated from citrated human venous blood with dextran sedimentation and studied. A luminometer was used to assay free radical generation. The reaction mixture contained 106 cells mL`1, luminol plus the stimulant (Formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine=FMLP, 2 uM) at 37°C. In cell-free experiments, hydrogen peroxide (H2O2), hypochlorous acid (HOC1), hydroxyl radical and peroxynitrite-induced luminol and/or lucigenin CL were produced by H202 (3.5 mM), sodium hypochloride (5 uM), FeSC«4 (40 nM), peroxynitrite (50 nM) and xanthine (0.1 mmol/L) with xanthine oxidase (0.2U/mL). The effects of local anesthetics were examined by adding it immediately prior to the administration of stimulant agent. Following peak CL measurement, the effects of local anesthetics were expressed as % change from the response to the stimulant alone.?56^ Lidocaine, prilocaine, bupivacaine and tetracaine inhibited FMLP induced-CL concentration dependently in isolated human leukocytes, whereas articaine activated at high concentrations. In cell free experiments, all of the studied local anesthetics markedly inhibited xanthine-xanthine oxidase induced- CL in a concentration dependent mannner. However, lidocaine, bupivacaine and tetracaine markedly activated hydrogen peroxide induced-CL while prilocaine inhibited. Additionally, prilocaine, articaine and tetracaine inhibited hydrogen peroxide induced lucigenin enhanced-CL. Only tetracaine inhibited ferrous iron- induced CL. All of the 5 local anesthetics inhibited hypochlorous acid induced CL. Other local anesthetics except prilocaine inhibited peroxynitrite induced luminol enhanced CL. The local anesthetics except prilocaine and bupivacaine inhibited peroxynitirite induced lucigenin enhanced CL. In conclusion, local anesthetics interacted with most of the free radicals and its metabolites, which could be considered to be responsible from the inhibition observed in isolated human neutrophils. Those results might contribute to the development of new molecules possessing antioxidant activities in accordance with the chemical structure of the local anesthetics.