HBsAg/ IgM ve HBsAg/IgG komplekslerinin saptanmasına yönelik ELISA sisteminin hazırlanması ve HBsAg (+) serum örneklerinde HBsAg ile ilişkili immün komplekslerin belirlenmesinde kullanımı

Abstract

ÖZET Dolaşımdaki immün komplekslerin (DİK) saptanmasında; polietilen glikol presipitasyonu, Clq veya konglütinin bağlı katı fazm kullanıldığı ELISA/RIA, RAJI hücreleri kullanılarak yapılan testler gibi çeşitli metodlar kullanılmaktadır. Ancak SLE hastalarında bulunan ANA ve anti-ds DNA otoantikorlannın RAJI hücrelerine bağlanması, bağ dokusu hastalıklarında görülen otoantikorlann yapısal olarak kollajene benzeyen Clq'ya bağlanabilmesi gibi olaylar seçilen test yöntemine bağlı yalancı pozitifliklere neden olabilmektedir. Daha önce yapılan çalışmalarda kronik hepatitit B enfeksiyonunda bildirilen yüksek DİK ve HBsAg içeren DİK oranlarının immün kompleks hastalığı insidansı ile paralellik göstermemesi DİK'lerin saptanmasında daha güvenilir metodlara ihtiyaç olduğunu düşündürmektedir. Bu çalışmada kronik HBV enfeksiyonunda HBsAg ile ilişkili IgG, IgM ve IgA içeren komplekslerin daha doğru olarak saptanabilmesi için üç kontrollü bir ELISA test sistemi geliştirildi. ELISA plakları anti-HBs IgGl ve anti-HBs IgM monoklonal antikorları ile kaplandı. Ayrıca özgül olmayan bağlanmaların saptanabilmesi için havuzlanmış fare serumundan kromotografîk yöntemle saflaştınlan anti-HBs(-) poliklonal IgG ile kaplı çukurlar da sisteme eklendi. Her üçü de HRPO ile işaretli anti-insan IgG, IgM ve polivalan Ig (IgG, IgM ve IgA) konjugatlan kullanıldı. Çalışma 168 HBsAg(+), anti-HBctotai(+), anti-HBc IgM(-) ve 56 HBsAg(-), anti-HBs(-), anti-HBctotai(-) serum örneği ile yapıldı. Hazırlanan ELISA sisteminde HBsAg/Ig kompleksi varlığı HBsAg(-) serumlardan elde edilen eşik değerlerine göre anti-HBs IgGl ve anti-HBs IgM kaplı çukurlarda pozitif, havuzlanmış IgG kaplı çukurda negatif olma kriterlerine göre tanımlandı. 168 HBsAg(+) serumdan sadece 3 tanesinin (% 1,8) bu kriterleri karşıladığı saptandı. Hazırlanan sistemle saptanamayan İK'lerin olabileceği düşünülerek aynı çalışma grubundan seçilen serumlar tanısal amaçla kullanılan ticari bir Clq-DİK ELISA testi ile de çalışıldı ve HBsAg(+) grupta bir (% 2,1), HBsAg(-) grupta bir (% 2,4) pozitiflik bulundu. Bu sonuçlar daha önce yapılan çalışmalarda kronik HBV enfeksiyonunda saptanan yüksek DİK oranlarının kullanılan yöntemlere bağlı yalancı poztiflikten kaynaklandığını düşündürmektedir.

İNGİLİZCE ÖZET (SUMMARY) Different methods such as polyethylene glycol precipitation, ELISA/RIA performed with Clq- or conglutinin-covered solid phase, tests using RAJI cells or thrombocytes have been used to detect circulating immune complexes (CIC). However, binding of ANA and anti-ds DNA autoantibodies in SLE patients to RAJI cells or of autoantibodies seen in connective tissue disorders to Clq that is structurally similar to collagen may cause false positivity. Since high ratios of CIC's and HBsAg containing CIC's reported in previous studies in chronic hepatitis B infection are not parallel to the incidence of immune complex diseases, it's thought that more reliable methods are needed in order to detect CIC's. In this study, a tripple-checked ELISA test has been developed for more accurate detection of HBsAg associated IgG, IgM and IgA complexes in chronic HBV infection. ELISA plates were covered with anti-HBs IgGl and anti-HBs IgM monoclonal antibodies. Besides, wells covered with anti-HBs(-) polyclonal IgG purified from pooled murine sera were added to the system to detect non-specific binding. Anti-human IgG, IgM and polyvalent Ig (IgG, IgM and IgA) conjugates, all of which were labeled with HRPO, were used. The study was performed by using 168 HBsAg(+), anti-HBctotai(+), anti-HBc IgM(-) and 56 HBsAg(-), anti-HBs(-), anti-HBctotai(-) serum samples. In the tripple-checked ELISA system, the presence of HBsAg/Ig complexes was determined with the criteria of being positive in anti-HBs IgG- and IgM-covered wells and of being negative in pooled IgG-covered well according to the cut-off values obtained from HBsAg(-) samples. Only 3 out of 168 (% 1.8) HBsAg(+) samples met the criteria. Thinking that there could be IC's undetected by the system, selected serum samples from the same study group were re-tested with a diagnostic commercial Clq-CIC ELISA test, and one (% 2.1) sample from HBsAg(+) group and one (% 2.1) sample from HBsAg(-) group were found to be positive. These data suggest that the previously reporeted high CIC ratios in chronic hepatitis B infection might have resulted from false positivity due to the methods used.