Epitelyal sodyum kanallarının (ENAC) insan sperm kapasitasyonu ve akrozom reaksiyonu ile ilişkisinin incelenmesi

Abstract

Kapasitasyon, spermlerin dişi üreme kanallarında fertilizasyon yeteneği kazandıkları bir süreçtir. Kapasitasyon sırasında iyon geçirgenliği azalmasına bağlı olarak sperm plazma membranı hiperpolarize olur. Epitelyal Na+ kanalları (ENaC) birçok organın fizyolojisinde önemli role sahip iyon kanallarıdır. Spermlerde de bulunan ENaC'lar kapasitasyon sırasında cAMP bağımlı yolaklarla inhibe olarak plazma membranının hiperpolarize olmasını sağlarlar. Vücutta enerji homeostazisini düzenleyen 5'-AMP ile aktive olan protein kinaz (AMPK), aynı zamanda somatik hücrelerde ve oositlerde plazma membranındaki ENaC-β ekspresyonunu azaltarak Na+ transportunun düzenlenmesinde görev alan bir kinazdır. Ancak spermlerde AMPK aktivasyonunun ENaC inhibisyonu ile ilişkisi bilinmemektedir. Bu çalışmada, immunositokimyasal, sperktrofotometrik ve flow sitometrik yöntemler kullanılarak, non-kapasitatif medyum (NCM), AMPK aktivatörü AICAR eklenmiş NCM medyum (NCM-A), kapasitatif medyum (CM) ve AICAR eklenmiş CM medyumlarda (CM-A) inkübe edilmiş insan spermlerindeki fizyolojik ve fonksiyonel değişiklikler incelenmiştir. ELISA yöntemi ile kapasitasyon sırasında hücrelerdeki AMPK aktivitesinin arttığı ve ENaC-β konsantrasyonunun azaldığı; AICAR'ın non-kapasite ve kapasite spermlerde AMPK aktivitesini arttırarak ENaC-β proteinin miktarını azalttığı bulunmuştur. Flow sitometrik analizlerle AMPK aktivasyonunun hücre içi Na+ konsantrasyonunda azalmaya ve hiperpolarizasyonda artışa neden olduğu, bu değişikliklerin kapasitasyonu arttırdığı ancak sperm canlılığına ve akrozom reaksiyonuna etki etmediği belirlenmiştir. Makler sayım kamarası ile yapılan değerlendirmeler, AMPK aktivasyonunun sperm ileri hareketliliğini arttırdığını göstermiştir. İmmunofloresan incelemelerde, ENaC-β'nın sperm kuyruğunun esas parçasında lokalize olduğu, AMPK aktivasyonu ile membrandaki ENaC-β miktarının azaldığı, spontan akrozom reaksiyonuna giren sperm sayısında ise değişiklik olmadığı görülmüştür. Bu sonuçlar, insan spermlerinin kapasitasyonu sırasında gerçekleşen AMPK aktivitesindeki artışın, plazma membranının hiperpolarizasyonu için ENaC'ları inhibe ettiğini ve hiperpolarizasyonun kapasitasyon ve ileri hareketlilik artışını indüklediğini göstermektedir. Bu özellikleri sayesinde ENaC'lar ve AMPK'nın depolarizasyon kaynaklı azalmış in vitro fertilizasyon (IVF) başarısının arttırılmasında yeni birer farmakolojik hedef olabilecekleri düşünülmektedir.

Capacitation is a process that sperm cells gain fertilizing ability in the female reproductive tract. Decrease of ion permeability during capacitation results in a sperm hyperpolarization. Epithelial Na+ channels (ENaC) are ion channels that play an important role in the physiology of many organs. ENaCs, which are also present in sperms, are inhibited by cAMP-dependent pathways and lead to hyperpolarization of the plasma membrane. 5'-AMP-activated protein kinase (AMPK), which regulates energy homeostasis in the body, is a kinase also involved in regulating Na+ transport by reducing ENaC-β expression in the plasma membranes of somatic cells and oocytes. However, the relationship between AMPK activation and ENaC inhibition in sperm cells is not known. In this study, physiological and functional changes in human sperms incubated in non-capacitating medium (NCM), AMPK activator AICAR added NCM medium (NCM-A), capacitating medium (CM) and AICAR added CM medium (CM-A) were examined by using immunocytochemical, spectrophotometric and flow cytometric methods. It was found by ELISA method that the AMPK activity is increased and the concentration of ENaC-β decreased in the cells during capacitation; AICAR reduced the amount of ENaC-β protein by increasing AMPK activity in non-capacitated and capacitated sperms. Flow cytometric analysis revealed that AMPK activation caused a decrease in intracellular Na+ concentration and an increase in hyperpolarization; these changes increased capacitation but did not affect sperm viability and acrosome reaction. Evaluations with Makler counting chamber showed that AMPK activation increased sperm progressive motility. Immunofluorescence studies indicated that ENaC-β was localized in the principal piece of the flagellum and the amount of ENaC-β on the membrane decreased and the number of sperms undergoing spontaneous acrosome reaction did not change with AMPK activation. These results indicate that the increases in AMPK activity occurring during capacitation of human sperm inhibit ENaCs to produce hyperpolarization of the plasma membrane and that the hyperpolarization induces the increases in capacitation and progressive motility. It is suggested that due to these properties, ENaCs and AMPK may be new pharmacological targets to improve in vitro fertilization (IVF) success which is decreased due to depolarization.