2,4-Dinitrotoluen`in bir Arthrobacter cholorophenolicus suşu ile biyodegradasyonu ve ilgili katabolik genlerin FISH tekniği ile belirlenmesi

Abstract

Bu çalışmada, petrol rafinerisinden alınan ham petrolle kontamine olmuş toprak örneklerinden zenginleştirme kültür metoduyla karbon ve azot kaynağı olarak 2,4-Dinitrotoluen (2,4-DNT) içeren MM9 besiyerinde 15 bakteri suşu izole edilmiştir. 30 °C sıcaklıkta 10 günlük inkübasyon sonrasında en iyi üreyen bakteri suşu identifikasyonu yapılmak üzere seçilmiştir. İdetifikasyon için 16S rRNA/DGGE metodu kullanılmış ve bakteri suşu Arthrobacter chlorophenolicus olarak teşhis edilmiştir. Bakteri suşunun farklı sıcaklık ve pH değerlerinde optimum degradasyon koşulları test edilmiştir. 2,4-DNT'nin optimum degradasyonunun 30 °C sıcaklıkta ve pH 7-8 aralığında gerçekleştiği tespit edilmiştir. 2,4-DNT'nin degradasyon kinetiği HPLC analizleriyle hesaplanmıştır.Plazmid eliminasyonu deneyleri sonucunda 2,4-DNT degradasyon yeteneğinin plazmid kaynaklı olduğu bulunmuştur. Bu plazmidin büyüklüğünün ise yaklaşık 8,125 kb olduğu tespit edilmiştir.Ham petrolle kirlenmiş toprak ve saf bakteri kültürü örnekleri ile gerçekleştirilen Floresan Yerinde Hibritleme (FISH) deneylerinde, 2,4-DNT degradasyon metabolik yolundaki dntAa ve dntD genlerine ait hibridizasyon sinyalleri gözlemlenmiştir.

In this study, soil samples which were contaminated by crude oil were used. 15 Bacterial strains were isolated with enriched culture method from this samples and 2,4-DNT used as a source of nitrogen and carbon in MM9 medium. The best growing strain was selected for identification after the incubation at 30 °C for 10 days. This bacterial strain was identified as Arthrobacter chlorophenolicus by using 16S rRNA/DGGE method. The optimum degradation conditions of this strain was tested at different temperatures and pH intervalues. Optimum 2,4-DNT degradation was found at 30 °C and pH 7-8. Moreover, the degradation kinetics of 2,4-DNT were determined by HPLC.2,4-DNT degradation ability of the bacterial strain was found to be plasmid-mediated through curing experiments. The size of this plasmid was estimated as about 8,125 kb.In fluorecent in situ hybridization (FISH) experiments, hybridization signals of 2,4-DNT degradation pathway genes, dntAa and dntD, were observed in crude oil contaminated soil and pure bacterial culture samples.