Pankreas karsinoma (BxPC-3) hücre hattında doxorubicin`in antikanser etkisinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmada BxPC-3 pankreas karsinoma hücreleri kullanılarak topoizomeraz II inhibitörü olan Doxorubicin'in apoptotik etkisi araştırılmıştır. xCELLigence DP eş zamanlı hücre analizi cihazında yapılan hücre titrasyon deneyleri sonucunda sitotoksisite deneyleri için uygun hücre sayısının 12500, Doxorubicin uygulama saatinin ise 26-28. saatler arası olduğu belirlenmiştir. Doxorubicin (500µM, 50µM, 25µM, 5 µM, 0.5µM) uygulaması sonucu IC50 değeri 8,64x10-7M olarak bulunmuştur. xCELLigence DP sisteminde gerçekleştirilen migrasyon deneyleri sonucunda BxPC-3 hücrelerinin besine duyarlı migrasyon göstermediği belirlenmiştir. Doxorubicin dozuna bağlı Kaspaz-3, Kaspaz-8, Kaspaz-9 gen ifadesi düzeylerinin niceliksel ölçümü 1 µM Doxorubicin uygulanarak 3., 6., 12., 24., ve 48. saatlerde qRT-PCR yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Kontrol grubuna göre Kaspaz-3 için 6. saatte 4 kat, 12. saatte ise etkinin azalarak yaklaşık 2 kat olduğu, Kaspaz-8 için 6. saatte yaklaşık 9 kat, 12. saatte yaklaşık 5 kat fazla ifade edildiği görülürken, Kaspaz-9 ifadesinde ise anlamlı değişiklik gözlemlenmemiştir. Doxorubicin'in apoptotik etkisinin belirlenmesi için akım sitometride 24 saat Doxorubicin'e maruz bırakılan hücreler ile gerçekleştirilen, FITC AnnexinV testinde hücrelerin %18.5'nin geç apoptotik, %9.3'ünün ise erken apototik evrede olduğu belirlenmiştir. PE Aktif Kaspaz-3 testinde kontrol grubu ile ilaç uygulaması yapılan hücreler arasında anlamlı farklılıklar gözlenmemiştir. DNA hücre döngüsü analizi ile Doxorubicin'in anti-mitotik etkisi (Go/G1, S ve G2/M fazlarındaki) yüzde oranlarına göre tutuklanma durumları karşılaştırılmıştır. İlaç uygulaması yapılan hücrelerin %77.69'unun G1 fazında olduğu belirlenmiştir. Bunun sonucunda topoizomeraz II inhibitörü olan Doxorubicin'în, BxPC-3 hücrelerinde apoptotik etkisi gözlenmiştir.

In this study, apoptotic activity of topoisomerase II inhibitor Doxorubicin is used on pancreatic carcinoma cell line BxPC-3. Optimum cell unit per well is determined to be 12500 by xCELLigence DP system. Also Doxorubicin treatment period is determined to be 26-28 hours. The application of dose dependent Doxorubicin (500µM, 50µM, 25µM, 5µM, 0.5µM) results with IC50 value of 8,64x107M. According to migration assay using xCELLigence DP system, BxPC-3 cells have not shown FBS dependent migration. The level of Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9 gene were measured with Quantitative Real Time PCR at 3, 6, 12, 24, 48 hours. Caspase-3 gene expression level fold increase four times at 6th hours, 2 times at 12th hours comparing to control. Caspase-8 gene expression level fold increase nine times at 6th hours, five times at 12th hours comparing to control. Caspase-9 gene expression level was not observed significant difference. To designate the apoptotic activity of Doxorubicin AnnexinV FITC and Active Caspase-3 PE test are applied by using flow cytometry. The result of AnnexinV FITC test the cells were measured as 18.5% and 9.3% for late apoptosis and early apoptosis respectively. In the results of Active Caspase-3 PE assay was not demonstrated significant difference between control and drug treatment cells. The test of DNA cell cycle analysis used to compare the anti-mitotic effect percentages of cell cycle arrest at G0/G1, S, and G2/M cycles.To the result of DNA cell cycle analysis, it has been shown that the cells were arrested at G0/G1 phase as measured 77.69%. As a result, Doxorubicin, a topoisomerase II inhibitor, showed to arrest the cell cycle at G0/G1 phase in pancreatic carcinoma cell line BxPC-3.