Coiled-coil domain containing protein 124 (Ccdc 124) artışının hücre fizyolojisine ve bölünmesine etkileri

Abstract

Ccdc124 (Coiled-coil domain-containing 124) memeli hücrelerinde işlevi yeni tanımlanmış bir proteindir. İnsan hücrelerinde proteinin lokalizasyonu hücre döngüsünün interfaz evresinde sentrozom; mitozun post-anafaz, telofaz ve sitokinez evrelerinde ise orta-cisimcik (midbody) olarak belirlenmiştir. Geçmişte yapılan bilimsel çalışmalarda Ccdc124 proteinini kodlayan genin susturulması durumunda hücreler üzerinde meydana gelen değişiklikler kısmi olarak araştırılmış ve bu durumun hücrelerin bölünememesiyle sonuçlandığı ve çok çekirdekli hücrelerin meydana gelmesine neden olduğu belirlenmiştir [Telkoparan, 2013]. Yapılan bu tez çalışmasında ise insan osteosarkoma hücre hattına (U2OS) ait hücreler üzerinde Ccdc124 proteininin aşırı ifade edilmesine bağlı değişikliklerin moleküler ve morfolojik düzeyde incelenmesi sağlanmıştır. Bu proteine ait genin, aşırı ifade edilmesinin sağlanması için insan Ccdc124 geni taşıyan ifade vektörleri kullanılmış ve ilgili genin transfeksiyona bağlı ifade artışı immünoblot analizleriyle doğrulanmıştır. İmmünofloresan analizler sonucunda ise aşırı ifade edilen Ccdc124 proteinin, G1 ve erken profaz evresinde sentrozomda konumlandığı bulgulanmıştır. Bunu takiben yapılan hücre akım sitometri analizleriyle de Ccdc124 proteinin ifadesindeki artışın sitokinez mekanizmasında olumsuz bir etki yaratarak sitoplazma bölünmesini engellediği ve populasyondaki çok çekirdekli hücre sayısında belirgin bir artışa sebep olduğu tespit edilmiştir. Çalışmaya ek olarak Ccdc124 proteiniyle etkileştiği bilinen ve bir orta cisimcik proteini olan RasGEF1B (Ras guanin nükleotit değiştirici faktör 1B)'nin birbirine bağlanma bölgeleri araştırılmıştır. Bu deney için transfekte edilen HEK 293 hücre hatlarına ait lizatlara birlikte çöktürme yöntemi uygulanmış, ardından kullanılan immünoblot yöntemiyle RasGEF1B'nin Ccdc124 protenine bu proteinin C son ucuna yakın olan bölgesinden bağlandığı bulgulanmıştır.

Ccdc124 (Coiled-coil domain-containing 124) is a protein whose function is newly identified in mammalian cells. It is localized at centrosome in interphase and at midbody zone in post anaphase, telophase and cytokinesis during the cell cycle in human cells. In previous studies it was shown that knocking-down Ccdc124 gene resulted in inhibition of cytokinesis and generation of multinuclated cells [Telkoparan et al., 2013]. In this thesis, it is aimed to investigate effects of Ccdc124 overexpression by morphological and molecular technics in human osteosarcoma cell line (U2OS). First of all, U2OS cells are transfected with human Ccdc124 expression vector to overexpress this protein and the expression level is controlled with western blot analysis. By using immunofluorescence analysis, it is determined that Ccdc124 protein is localized at centrosome in G1 and early prophase. Additionally, flow cytometry analyses show that the overexpression of this protein causes cytokinesis failure and a significant increase in the number of multinucleated cells. In the second part of this study, the interaction between Ccdc124 and a midbody protein Ras guanine-nucleotide exchange factor (RasGEF1B) is investigated in human embryonic kidney 293 (HEK 293) cell line by co-immunoprecipitation (CoIP) method. Finally it is discovered that Ccdc124 protein has a binding region at its C terminal for the interaction of RasGEF1B.