Bacillus sp. P22 soyu alkalen proteazının üretim koşullarının optimizasyonu, enzimin saflaştırılması ve nitelendirilmesi

Abstract

Alkalen proteazlar proteinleri oluşturan amino asitler arasındaki peptit bağlarının hidrolizini alkali koşullarda katalizleyen önemli endüstriyel enzimlerdir. Dünya enzim pazarında yaklaşık % 60 pay sahibi olan alkalen proteazlar başta deterjan, süt ürünleri, gıda ve deri endüstrilerinde olmak üzere pek çok endüstriyel süreçte kullanılmaktadır. Bu çalışmada, yerel bir izolat olan Bacillus sp. P22 alkalen proteazının üretim koşullarının optimize edilmesi, enzimin saflaştırılması ve nitelendirilmesi amaçlandı. Bu amaçla, çeşitli karbon ve azot kaynakları ile metal tuzları gibi besi yeri bileşenleri ve sıcaklık, pH, aşılama miktarı, çalkalama hızı, havalandırma oranı gibi inkübasyon koşulları test edilerek, enzim üretiminin en iyi olduğu fermentasyon şartları belirlendi. Enzim amonyum sülfat çöktürmesi, iyon değiştirici kromatografi ve moleküler elek kromatografisi yöntemleri ile üç basamakta % 21 verimle 13 kez saflaştırıldı. Kısmen saflaştırılan enzim ile gerçekleştirilen nitelendirme çalışmaları sonucunda; Bacillus sp. P22 alkalen proteazının optimal çalışma sıcaklığının 40 °C ve optimal çalışma pH değerinin 10.5 olduğu belirlendi. Enzimin 15-50 °C ve pH 8-11 aralıklarında kararlı olduğu, 10 mM CaCl2'ün 50 ve 60 °C'ta enzimin sıcaklık kararlılığını önemli ölçüde artırdığı görüldü. 10 mM EDTA ve PMSF varlığında proteolitik aktivitenin inhibe olduğu, enzimin SDS, Triton X-100, Tween 80, Tween 20 gibi deterjanlar ve aseton, etanol, metanol, izopropanol ve etilen glikol gibi organik çözücüler varlığında aktivitesini önemli ölçüde koruduğu gözlendi.

Because of their capability of cleaving peptide bonds between amino acids at alkaline conditions, alkaline proteases have broad applications in detergent, food, dairy and leather industries where stability and activity are required in tough conditions. Constituting 60 % of the global enzyme market alkaline proteases are significant industrial enzymes. In this study, production of alkaline protease of the local isolate Bacillus sp. P22 was optimized, the enzyme was purified and its charactheristics were determined. The optimum media composition that is promoting enzyme production was defined by testing different carbon and nitrogen sources and metal salts as well as varied incubation temperature, pH, inoculum rate, agitation speed and aeration ratio. The enzyme was purified for 13 times with 21 % yield in three steps employing ammonium sulphate precipitation, ion exchange and gel filtration chromatographies. In following characterization studies the optimal reaction temperature and pH of Bacillus sp. P22 alkaline protease were found to be 40 °C and 10.5 respectively. The enzyme was found to be stable in 15-50 °C and pH 8-11 ranges whereas its temperature stability was increased in the presence 10 mM CaCl2 at 50 and 60 °C. Enzymatic activity was inhibited in the presence of 10 mM EDTA and PMSF. Proteolytic activity of Bacillus sp. P22 alkaline protease retained to a great extent in the presence of detergents SDS, Triton X-100, Tween 80, Tween 20 and organic solvents acetone, ethanol, methanol, isopropanol and ethilene glycol, thus proving the potential of Bacillus sp. P22 alkaline protease as a detergent additive.