CRISPR/Cas9 yöntemi aracılığı ile insan CCDC 124 geni delesyonunun hücre bölünmesi üzerine etkileri

Abstract

Mantardan insana kadar tüm ökaryotlarda korunmuş bir protein olan Ccdc124 lokalizasyonu ve işlevi yeni tanımlanmış bir sentrozom proteinidir. Memeli hücrelerinde, hücre döngüsünün anafaz evresine kadar sentrozomda konumlanan Ccdc124 proteini post-anafaz evresinde orta cisimciğe (midbody) göç etmektedir. Daha önce yapılan çalışmalarla CCDC124 geninin ifadelenmesinin baskılandığı veya aşırı arttırıldığı durumlarda hücrelerin sitokinezi başarıyla tamamlayamadığı ve çok çekirdekli hücrelerin meydana geldiği belirlenmiştir [Telkoparan, 2013], [Arslan, 2015]. Yapılan bu çalışmayla bu proteine ait genin, günümüzde en çok çalışılan yöntemlerinden biri olan CRISPR/Cas9 yöntemi ile delesyona uğratılması amaçlanmıştır. Bu doğrultuda, HEK293T hücrelerinde CCDC124 geninin 2. ve 3. ekzonlarını hedefleyen CRISPR/Cas9 rehber oligoları tasarlanmış ve bu bölgelerde oluşan çeşitli uzunluklarda delesyon ve insersiyonlar sekans analizleriyle doğrulanmıştır. Elde edilen CCDC124 geni modifikasyonlarının, bazı mutant hücre hatlarında proteinin ifadelenmesinin tamamen ortadan kalkması ile bazı mutant hücre hatlarında ise daha küçük bir proteinin sentezlenmesi ile sonuçlandığı immünoblot teknikleriyle saptanmıştır. Mutant hücre hatlarında meydana gelen morfolojik değişiklikler mikroskobik görüntüleme teknikleri kullanılarak kaydedilmiştir. Akım sitometri analizleriyle genin mutasyona uğratılmasının sitokinez mekanizmasında olumsuz bir etki yaratarak sitoplazma bölünmesini engellediği ve populasyondaki çok çekirdekli hücre sayısında belirgin bir artışa sebep olduğu tespit edilmiştir. Bunu takiben immünboyama çalışmalarında çekirdeğe özgü antikor kullanılarak tek bir hücre zarı içerisinde çoklu çekirdek yapısı gözlemlenmiştir.

Ccdc124 (Coiled-coil domain-containing 124), conserved from fungi to humans, is a centrosome protein whose function and localisation is recently identified. In mammals, it is localized at centrosome until anaphase and migrates to the midbody in post anaphase during the cell cycle. In previous studies it was shown that cells with under/over expressed CCDC124 gene failed to complete cytokinesis and turned into multinuclated cells [Telkoparan, 2013], [Arslan, 2015]. The aim of this study is the deletion of the CCDC124 gene by CRISPR/Cas9 system which is one of the most recent common techniques nowadays. Accordingly, CRISPR/Cas9 guide oligonucleotides targeting the second and third exons of CCDC124 gene in HEK293T cells are designed as well as various deletion and insertion mutations in the relevant locus were validated by sequence analysis technique. The CCDC124 gene modifications in some of the mutant cell lines resulted in a total disappearance of the protein expression whereas some other mutant cell lines appeared with a little protein expression which are detected with a immunoblotting tecniques. The morphological changes of mutant HEK293T cells are analyzed by microscopic screening techniques. Mutations of the gene has caused a negative effect on the cytokinesis machinery and prevented the cytoplasmic division and along with the significant increase in the polynuclear cell number. In addition to this, the nuclei of polynuclear cells are observed by using specific antibodies in immunostaining study.