Okratoksin A güdümlü karsinogenez mekanizmalarının HK-2 hücrelerinde sinyal ileti yolakları ve proteom düzeyinde incelenmesi

Abstract

Okratoksin A (OTA) boşaltım organlarına ait tümörlerin ve Balkan Endemik Nefropati'nin nedeni olduğu düşünülen bir mikotoksindir. Hayvan deneylerinde OTA karsinojenitesi açıkça gösterilmiş olmasına rağmen, OTA teşvikli karsinogenez mekanizmaları tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu nedenle, in vitro bir sistem kullanılarak OTA teşvikli karsinogenez ve toksisite mekanizmalarının ortaya çıkarılması hedeflenmiştir. Çalışmanın ilk bölümünde, moleküler biyolojik teknikler kullanılarak OTA etkisi altındaki sinyal yolaklarının aktivasyon durumları araştırılmıştır. İnsan proksimal tübül epitel (HK-2) hücrelerinde OTA'nın doz- ve zaman-bağımlı olarak PI3K/Akt ve MEK/ERK1-2 sinyal yolaklarının uzun süreli aktivasyonunu tetiklediği gösterilmiştir. Ayrıca, HK-2 hücrelerinde OTA'ya cevaben bu iki yolağın zıt rollere sahip olduğu, OTA ile aktive edilen PI3K/Akt sinyal yolağı hücre sağkalımını desteklerken, OTA teşvikli MEK/ERK1-2 sinyal yolağının uzun süreli aktivasyonunun apoptoza götürdüğü belirlenmiştir. OTA muamelesi yapılan hücrelerde, ERK1-2 aktivasyonunun kimyasal inhibisyonu ya da dominant-negatif ve kinaz-inaktif MEK1'in aşırı ifadesi hücre canlılığında artışla ve apoptotik hücre ölümünde azalmayla sonuçlanmıştır. PI3K/Akt sinyalinin Wortmannin ile inhibisyonu OTA'nın hücre canlılığına negatif etkisini ve apoptoz seviyelerindeki artışı daha da şiddetlendirmiştir. Ayrıca, HK-2 hücrelerinde, c-MET proto-onkogeni, OTA teşvikli PI3K/Akt sinyal aktivasyonundan sorumlu olan fakat MEK/ERK1-2 aktivasyonundan sorumlu olmayan bir reseptör tirozin kinaz olarak tanımlanmıştır. Çalışmanın ikinci bölümünde, LC-MS/MS analizi ile, OTA'nın renal toksisitesinin mekanistik süreçlerini daha iyi anlamak için proteomik yaklaşım kullanılmıştır. OTA muamelesi yapılan hücrelerde 393 farklı protein tanımlanmıştır. Bu proteinlerden 40 tanesinin ifadesinde artma, 56 tanesinin ifadesinde azalma olduğu tespit edilmiştir.

Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin suggested to be a causative agent for urethelial tract tumors and Balkan Endemic Nephropathy. Even though in animal experiments the carcinogenicity of OTA has clearly been shown, the precise mechanisms underlying OTA-induced carcinogenesis remain unclear. Therefore, it was aimed to unearth the mechanism(s) of OTA-induced carcinogenesis and toxicity utilizing an in vitro system. In the first part of this study, it was investigated the activation status of the signaling pathways under OTA influence using molecular biological techniques. It was demonstrated that OTA induced sustained activation of the PI3K/Akt and MEK/ERK1-2 signaling pathways in a dose- and time-dependent manner in human proximal tubule epithelial (HK-2) cells. Moreover, it was demonstrated that these two pathways have opposite roles in response to OTA, while OTA-activated PI3K/Akt signaling pathway supports cell survival, OTA-induced sustained activation of the MEK/ERK1-2 signaling pathway leads to apoptosis in HK-2 cells. Chemical inhibition of ERK1-2 activation or overexpression of dominant-negative and kinase-dead MEK1 result in increased cell viability and decreased apoptotic cell death in OTA-treated cells. Inhibition of PI3K/Akt signaling with Wortmannin aggravated the negative effect of OTA on cell viability and increased the levels of apoptosis. Furthermore, the c-MET proto-oncogene was identified as one of the upstream receptor tyrosine kinase responsible for OTA-induced activation of PI3K/Akt signaling but not MEK/ERK1-2 activation in HK-2 cells. In the second part of this study, proteomics approach was employed to gain further insight into the mechanistic processes of the renal toxicity of OTA using LC-MS/MS analysis. A total of 393 distinct proteins were identified from which 40 were upregulated and 56 were downregulated in OTA-treated cells.