Development of optogenetic tools based on cryptochrome protein

Abstract

Işık, ışığa duyarlı proteinler aracılığı ile sinyal yolaklarının kontrolünü sağlamak için kullanılır, bu sistem optogenetik olarak adlandırılır. Işığa duyarlı yeni aday proteinlerin bilinen optogenetik araçlara uyarlanması hücresel aktivitelerin ışık ile daha kesinlikte gözlemlenmesini ve kontrol edilmesini sağlayabilir. Çoğu organizmada sirkadiyen ritimleri resetleyen Cryptochrome proteinleri potansiyel optogenetik araçlar olarak oldukça ilgi çekicidir. Drosophila Cryptochrome (CRY) proteini fotoreseptördür, dolayısıyla, Drosophila CRY proteininin memeli hücrelerine aktarımı bu hücreleri ışığa duyarlı yapabilir. Bu çalışmada, Drosophila CRY proteini kullanılarak yeni bir optogenetik araç geliştirmek amaçlanmıştır. Memeli hücrelerinde endojen gen ekspresyonu ve protein aktivitesini ışıkla kontrol etmek için, Drosophila CRY proteini ve onun ışık partneri Jetlag proteini kullanılmıştır. Bu ışık ışık sistemini kullanarak, endojen bir genin ifadesini kontrol etmek için Retinoid X Reseptör (RxR) proteinin ligand bağlanma domaini silinerek dimerizasyonu engellenmiş ve ışık verildiği zaman CRY ve JET proteinlerinin bir araya gelerek RxR ın dimerize olmasını sağlaması ve p21 ekspresyonunu aktive edebilmesi beklenmiştir. RxR-CRY ve RxR-JET konstraktları HEK293T hücrelerinde olarak eksprese edilmiş ve bu hücreler 0,02mW/cm2 ışık şiddetine maruz bırakılmıştır. Öncelikle, p21 mRNA artışı kuantatif PCR ( qPCR) ile gösterilmiştir. Ardından 36 saate kadar ışık muamelesine bırakılan hücrelerle yapılan immunoblot sonuçları p21 proteinin ışığa bağımlı olarak arttığını göstermiştir. Sonuç olarak, Drosophila Cryptochrome proteininin iyi bir optogenetik araç adayı olduğu bulunmuştur. Bu sistem klasik gen regülasyon sistemlerine alternatif önermektedir ve araştırma ve biyoteknolojik amaçlar için yaygın bir kullanım alanı bulabilir.

Light is used to control signaling pathways via photosensitive proteins, this technology is called optogenetics. Adoption of new light sensitive proteins into optogenetic methods improves the control and observation of cellular events with high temporal precision. Cryptochrome proteins which have function to reset circadian rhythms in many organisms are highly attracted as possible optogenetic tools. Drosophila Cryptochrome (CRY) is photosensory receptor; therefore introduction of Drosophila CRY into mammalian cells can render these cells sensitive to light. In this study, it is aimed the development of a new optogenetic tool by using Drosophila CRY protein. To develop a molecular tool to control endogenous gene expression and protein activity by light in mammalian cells, it was exploited that the light-dependent interaction between Drosophila CRY and Jetlag proteins. To test regulation of an endogenous gene expression with this light system, Retinoid X Receptor (RxR) protein was used without dimerization domain, and it was expected that light induced interaction between CRY and JET allow dimerization of truncated RxR, then activate p21 gene expression. Both Rxr-dCRY and Rxr-JET constructs were expressed in HEK293T cells and these cells were exposed the black light at 0,02mW/cm2 intensity. Firstly, p21 mRNA upregulation was shown by qPCR light-dependently. Then, immunoblotting assays up to 36 hrs. showed that p21 protein expression enhanced upon light exposure. In conclusion, it was found that Drosophila CRY is good candidate as an optogenetic tool. This system offers an alternative to classical gene regulation systems and may find large application area for research and biotechnological purposes.