Pirüvat dehidrogenaz enzim kompleksi aktivitesinin ve ekspresyonunun kanser hücrelerinde incelenmesi

Abstract

Hücrelerde pirüvat dehidrogenaz enzim kompleksi (PDC)'nin regülasyonunu sağlayan ve bilinen hücreye özgü iki pirüvat dehidrogenaz fosfataz (PDP) ve dört pirüvat dehidrogenaz kinaz (PDK) izoenzimi bulunmaktadır. PDK, PDC'yi fosforlayarak inaktive ederken, PDP'nin rolü fosforu kaldırarak PDC'yi aktif hale getirmektir. Hipoksik şartlarda, hipoksia-indüklenebilen faktör–1 (HIF1)'in, glikolitik enzimlerin ve PDK1'in ekspresyonlarını artırdığı belirtilmiştir. PDK ekspresyonunun artması PDC aktivitesini düşürmekte ve bu durum mitokondride gerçekleşen oksidatif fosforilizasyonunu yavaşlatmakta ve aynı zamanda da serbest radikal türleri (ROS)'nin oluşumunu azaltmaktadır. HIF-1 mekanizması, kanser hücrelerinde aktif görev oynayarak hücrelerin apoptosize uğramasını engellemektedir. Ayrıca, kanser hücrelerinde HIF1-indüklemeli PDK1 ekspresyonu bloke edildiğinde, hücrelerde ROS oluşumunun arttığı ve buna bağlı olarak hücre ölümünün gerçekleştiği belirtilmiştir. Bu veriler doğrultusunda, PDK aktivitesini inhibe ederek PDC aktivitesinin arttırılabileceği ve böylece kanserli hücrenin oksidatif fosforilizasyona yönlendirilerek apoptosize uğratılabileceği görüşü ileri sürülmüştür. Bu çalışmamızda, ilk olarak PDC ile PDK ve PDP izoenzimlerinin aktivitelerini, üç farklı meme kanseri hücre hattında incelenmiştir. Takibinde aynı hücrelerde PDP, PDK gen ve protein ifadelerindeki değişimler incelenmiştir. Aktivite ölçümleri hipoksik stabilizasyondan dolayı endojen PDP'lerin fonksiyonlarını yitirdiğini gösterilmiştir. PDP, PDK gen ve protein ifadelerindeki değişimler ise aktivite ölçümleri ile uyumlu bulunmuştur. İlaveten alfa-ketogluterat dehidrogenaz (α-KGDC) enzimin ve suksinat dehidrogenaz (SDH) enziminin aktiviteleri de izlenmiştir. Hipoksik şartlarda, normoksik şartlar ile karşılaştırıldığında bu aktivitelerin yaklaşık 2.5 kat azaldığı gözlemlenmiştir. Bu çalışmalara ilaveten böbrek kanseri (ACHN) ve insan göbeği damar endotel hücreleri (human umbilical vein endothelial cells, (HUVEC) hücrelerinde, PDK inhibitörü dikloroasetik asit (DCA)'in proliferasyon, apoptoz ve metabolit değişimlerine etkileri de incelenmiştir. DCA'nın böbrek kanseri üzerinde seçicilik göstererek apoptozu uyarmasıyla TCA çevriminin yeniden tetiklendiği düşünülmektedir.

The activity of PDC is regulated by two phosphatase (PDP) and four kinase (PDK) isoenzymes. PDK phosphorylates and inhibits PDC, whereas PDP removes the phosphate group(s) restoring its activity. Under hypoxic conditions, hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) stimulates glycolysis by inducing transcription of glycolytic enzymes and suppresses oxidative phosphorylation and thus formation of reactive oxygen species (ROS) in mitochondria by upregulating PDK1 expression. In normal cells, under hypoxic conditions (e.g. exercising muscle) this mechanism protects cells from apoptosis. HIF-1 also plays similar role (i.e. upregulates transcription of glycolytic enzymes and PDK1) in cancer cells and therefore protects these cells from ROS-induced apoptosis. It has been known that when HIF-1-induced PDK1 expression is blocked, production of ROS leads to apoptosis. Besides, forced PDK1 expression in hypoxic HIF-1 null cells increases ATP levels, attenuates hypoxic ROS generation, and rescues these cells from hypoxia-induced apoptosis. Based on these results, it has been suggested that by blocking PDK1 activity, which results in increased PDC activity and thus increased oxidative phosphorylation as well as ROS generation, apoptosis can be induced in hypoxic cancer cells. In this thesis, we aim to investigate the activities of PDC and its regulatory enzymes, as well as the expression levels of PDK and PDP isoenzymes in three different breast cancer. Also, the activities of TCA cycle enzymes α-ketogluterate dehydrogenase and succinate dehydrogenase (SDH) was measured. In hypoxic conditions, all of these activities decreased by ~2.5 fold compared to normoxic conditions. Finally, the effects of PDK inhibitor dichloroacetic acid (DCA) on proliferation, apoptosis and metabolite changes in renal cancer cells and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) cells was examined. DCA selectively induced apoptosis in cancer cells which may be accomplished by triggering the TCA cycle.