Aspergillus terreus NRRL 1960 ksilanazının saflaştırılması, kristalizasyonu ve biyokütle hidroliz başarımının belirlenmesi

Abstract

Bu çalışmanın amacı, Aspergillus terreus NRRL 1960 ksilanazının saflaştırılması ve X-ışını difraksiyonu tekniği ile üç boyutlu yapı analizi için enzim kristallerinin üretilmesidir. Bu amaçla, enzim üretimi, saflaştırılması ve kristalizasyonu gerçekleştirilmiştir.Enzim üretimi, batık kültür fermantasyon tekniği kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Saflaştırma süreci sırasıyla amonyum sülfatla çöktürme, hidrofobik etkileşimli kolon kromatografisi ve ultrafiltrasyon aşamalarından oluşmaktadır. Sonuç olarak ksilanaz, %10 verimle 256-kat saflaştırılmış ve kristalizasyon çalışmaları için kullanılmıştır. Enzimin moleküler ağırlığı SDS-PAGE ile 18 kDa olarak belirlemiştir.Enzim kristalizasyonu asılı ve oturan damla buhar difüzyonu teknikleri kullanılarak yapılmıştır. Kristal üretimi için dört farklı ticari kit kullanılarak kristalizasyon koşul taraması yapılmış ve dört ayrı başlangıç kristalizasyon koşulu belirlenmiştir. Elde edilen kristallerin kalitesinin iyileştirilmesi amacıyla koşullar optimize edilmiştir. Optimizasyon sonucunda, X-ışını difraksiyonu için en uygun kristaller, 1,5 M amonyum sülfat, 0,1 M Tris (pH 8,5), %12 (h/h) gliserol içeren çöktürme reaktifi kullanılarak 18°C sıcaklıkta, asılı damla buhar difüzyonu tekniğiyle elde edilmiştir.Ksilanazın farklı lignoselülozik materyaller üzerindeki hidrolitik etkisinin belirlenmesi amacıyla mısır koçanı, buğday kepeği ve ticari ksilan hidrolize edilmiştir. Yapılan hidroliz tepkimeleri sonucu yüksek konsantrasyonda indirgen şeker elde edilmiştir. Böylece, ksilanazın kullanılan kaynaklar üzerinde hidrolitik etkiye sahip olduğu sonucuna varılmıştır.Anahtar kelimeler: Aspergillus terreus, Ksilanaz, Hidrofobik Etkileşimli Kolon Kromatografisi, Enzim Saflaştırma, Enzim Kristalizasyonu, Biyokütle Hidrolizi.

The purpose of this study was purification of Aspergillus terreus NRRL 1960 xylanase and production of enzyme crystals for three dimensional structure analysis by X-ray diffraction technique. For this aim, enzyme production, purification and crystallization were performed.Enzyme production was carried out by using submerged fermentation technique. The purification process consisted of ammonium sulphate precipitation, hydrophobic interaction column chromotography and ultrafiltration steps, sequentially. As a result, xylanase was purified 256-fold with 10% yield and was further used for crystallization studies. The molecular weight of enzyme was determined as 18 kDa by SDS-PAGE.Enzyme crystallization was performed by using hanging and sitting drop vapor diffusion techniques. For crystal production, screening of crystallization conditions by using four different commercial kits was done and four different initial crystallization conditions were determined. To enhance the quality of obtained crystals, conditions were optimized. In consequence of optimization, the most suitable crystals for the X-ray diffraction were obtained by using a precipitation reagent containing 1.5 M ammonium sulphate, 0.1 M Tris (pH 8.5), 12% (v/v) glycerol, at 18°C with hanging drop vapor diffusion technique.In order to determine the hydrolytic effect of xylanase at lignocellulosic resources, corn cob, wheat bran and commercial xylan were hydrolyzed. As a result of hydrolysis reactions, reducing sugars at high concentrations were obtained. Therefore, it was concluded that xylanase has hydrolytic effect on the utilized lignocelluosic sources.Key words: Aspergillus terreus, Xylanase, Hydrophobic Interaction Column Chromotography, Enzyme Purification, Enzyme Crystallization, Biomass Hydrolysis.