Streptococcus pneumoniae için DNA aptamerlerin geliştirilmesi ve karakterizasyonu

Abstract

Pnömokoklar çocuklarda, yaşlılarda, immün yetmezliği olanlarda yaptığı enfeksiyonlarla dünyada başta gelen hastalık nedenleri arasında bulunmaktadır. Son yıllarda antibiyotiklere dirençli Streptococcus pneumoniae suşları giderek yaygınlaşmıştır. Aptamerlerin yüksek afinite ve seçicilik özellikleri sayesinde, terapötik, biyoanalitik uygulama ve moleküler tanı alanlarında kullanımlarının yüksek potansiyele sahip oldukları yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Bakteriyel-SELEX aptamer üretim yöntemi ile bakterilerdeki bilinmeyen biyomarkörlerin tespit edilmeleri sağlanabilmekte ve geliştirilen bu aptamerler tanı amaçlı kullanılabilmektedir. Bu çalışmada S. pneumoniae'ya karşı bakteriyel SELEX yöntemi kullanılarak aptamerler geliştirilmiştir. SELEX esnasında S. pneumoniae (ATCC® 49619™) hedef olarak kullanılırken, Streptecoccus mutans (ATCC® 25175™), Streptococcus pyogenes (ATCC® 19615™) ve Enterococcus faecalis(ATCC® 19433™) negatif seçilimde kullanılarak aptamerlerin özgünlüğü arttırılmıştır. Yapılan 20 turluk SELEX sonrasında zenginleşen diziler yeni nesil dizileme ile belirlenmiş ve sentezlenmiştir. Test edilen aptamerler arasında üç aday submikromolar seviyede (844,7±163,6 nM, 1984,8±347,5 nM, 661,8±111,3 nM) Kd değerlerine sahip olup S. pneumoniae'nın dört farklı suşuna karşı bağlanma etkinliği göstermiş fakat seçilimde kullanılan bakterilere etkin bağlanma göstermemiştir. Aptamerlerin bağlanma etkinlikleri floresans spektroskopi, floresans mikroskopi ve akım sitometrisi kullanılarak gösterilmiştir. Bununla birlikte geliştirilen aptamerlerin biyofilm oluşumu seçici olarak inhibe ettiği gösterilmiştir. Geliştirilen bu aptamerler literatürde bulunan ilk S. pneumoniae aptamerleridir, fonksiyonel olarak S. pneumoniae'e bağlanmakta ve anti pneomococcal potansiyeli bulunmaktadır.

Pneumococci is among the foremost causes of disease in children, the elderly and people with immune deficiency. Lately, antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae strains have become more and more prevalent. In studies conducted, aptamers through their high affinity and selectivity, have been proven to be of high potential in therapeutic and bioanalytical application and molecular diagnosis. The detection of unknown biofactors in bacteria has been made possible by the bacterial-SELEX aptamer production procedure and these aptamers can then be used for diagnostic purposes. In this study, aptamers against S. pneumoniae have been synthesized through the bacterial-SELEX procedure; S. pneumoniae (ATCC® 49619™) has been used as target while the distinction of the aptamers have been provided by using Streptecoccus mutans (ATCC® 25175™), Streptococcus pyogenes (ATCC® 19615™) and Enterococcus faecalis(ATCC® 19433™) in negative selection. After 20 rounds of SELEX, strains that have been enriched had been detected by new generation sequencing and synthesized. Three candidates among all the aptamers tested demonstrated Kd value in the submicromolar level (844,7±163,6 nM, 1984,8±347,5 nM, 661,8±111,3 nM) and showed binding activity to four different strains of S. pneumoniae, but not to the bacteria used in negative selection. Binding activities of aptamers have been demonstrated with the help of fluorescence spectroscopy, fluorescence microscopy and flow cytometry. It has also been shown that aptamers selectively inhibit the development of biofilm. These aptamers are the first S. pneumoniae aptamers found in the literatüre, they bind S. pneumoniae functionally, and they have anti pneumococcal potential.