Kars yöresinde sığırlarda cryptosporidium türlerinin prevelansı ve moleküler karakterizasyonu

Abstract

Kars Yöresinde Sığırlarda Cryptosporıdıum Türlerinin Dağılımı veMoleküler KarakterizasyonuBu çalışma, Kars yöresinde sağlıklı ve ishalli sığırlarda bulunan Cryptosporidium türleri ve bunların dağılımını belirlemek ve elde edilen C. parvum türünün subtiplerini ortaya koymak amacıyla yapılmıştır.Çalışma 2010 yılı Şubat-Haziran ayları arasında 30 köyden seçilen 62 çiftlikte yürütülmüştür. Sağlıklı ve ishalli sığırların rektumlarından toplam 870 dışkı, buzağıların bulundukları yerlerlerden de buzağı altlık örnekleri alınmıştır. Örnekler önce modifiye Asit Fast (MAF) boyama yöntemi ile Cryptosporidium yönünden incelenmiş, pozitif olanlar doymuş NaCl yöntemi ile zenginleştirilerek DNA extraksiyonunda kullanılmak üzere saklanmıştır. DNA ekstraksiyonu ticari kitlerle (Qiagen Stool Mini Kit) yapılmıştır. Cryptosporidium türlerini ortaya koymak amacıyla bu soyun 18S rRNA gen bölgesini hedef alan nested PCR yapılmıştır. Farklı türlerin ortaya konması için PCR ürünleri restriksiyon enzimleri ile kesilmiştir. Cryptosporidium parvum alt türlerini ortaya koymak için ise GP60 gen bölgesi çoğaltılıp elde edilen ürünler saflaştırılarak sekans analizi yapılmıştır.Modifiye asit fast boyama yöntemi ile 870 dışkı örneğinin 166'sında Cryptosporidium ookistleri görülmüştür. Ookistlere 60 buzağı altlık örneğinin 23' ünde rastlanmıştır. Cryptosporidium türlerinin yerleşim yerlerinde görülme oranı % 53,3 (16/30), bu yerleşim yerlerindeki çiftlik dağılımı % 41,9 (26/62) olarak bulunmuştur. Cryptosporidium türlerinin dağılımı; neonatal buzağılarda % 16,3 (25/153), 1-3 aylık buzağılarda % 22,3 (56/251), 4-6 aylık buzağılarda % 17,2 (5/29), 7-24 aylıklarda % 19,1 (13/68) ve ineklerde % 18,2 (67/369) oranlarında belirlenmiştir. Modifiye asit fast boyama ile Cryptosporidium pozitif sayılan 129 dışkı örneğinin 80'inde (% 62,0) Cryptosporidium pozitif PCR ürünü belirlenmiştir. Kars yöresindeki sığırlarda C. parvum (% 16,2; 13/80), C. bovis (% 45,0; 36/80) ve C. ryanae (% 38,8; 31/80) türleri saptanmıştır. Buzağılarda C. parvum % 20,0, C. bovis % 46,0, C. ryanae % 34,0, ergin sığırlarda ise C. parvum % 10,0, C. bovis % 43,3, C.ryanae % 46,7 oranlarında bulunmuştur. İshalli buzağılarda C. parvum daha yaygın (% 61,5; 8/13) görülmüştür. Cryptosporidium parvum'un IIa (12/13) ve IId (1/13) subtipleri ve bunların IIaA15G2R1 (10/13), IIaA16G3R1 (2/13) ve IIdA15G1 (1/13) subtipleri/subgenotipleri tespit edilmiştir.Sonuç olarak; Kars yöresindeki sığırlarda Cryptosporidium dağılımının yüksek olduğu, zoonotik olan C. parvum IIa subtip familyası ve IIaA15G2R1 subtipinin yaygın olduğu saptanmıştır. Bu sonuç zoonotik Cryptosporidium potansiyeli nedeniyle bölgedeki buzağıların insanlar için önemli risk olduğunu göstermektedir.

Distribution and Molecular Characterisation of Cryptosporidium Species in Cattle in Kars Region of TurkeyThis study was carried out to obtain the distribution and species composition of Cryptosporidium spp in cattle in Kars region of Turkey and further demonstrate the subtypes of C. parvum.The study was carried out between February-June 2010 in 62 farms selected from 30 localities. Fecal samples were taken from rectum of the animals and base of calf housing. Samples were examined by mAF and positive ones were subjected to NaCl flotation and further processed for DNA extraction. Nested PCR was utilized to amplify a region of Cryptosporidium 18S rRNA. Positive samples were procesed by RFLP to discriminate the species. DNA of C. parvum positive samples was later subjected to PCR aiming to amplfy GP60 gene. PCR products were sequenced in order to discriminate C. parvum subtypes.Cryptosporidium oocysts were observed in 166 out of 870 fecal samples by mAF. Oocysts were found in 23/60 fecal samples obtained from calf housings. The distribution was 16/30 and 26/62 at locality and form level respectively. Oocysts were observed in 25/153, 56/251, 5/29, 13/68 and 67/369 neonathal, 1-3, 4-6, 7-24 months old calfs and cattle respectively. Positive amplification products were obtained from 80 out of 129 mAF positive samples subjected to nested PCR. Three species were obsered; C. parvum 13/80, C. bovis 36/80 and C. ryanae 31/80. In calf species was as 20.0% C. parvum, 46.0% C. bovis and 34.0% C. ryanae, while in old cattle it was as 10.0% C. parvum, 43.3% C. bovis and 46.7% C. ryanae. Cryptosporidium parvum was higher (8/13) in diarrhoeic calfs. Sequencing revealed 12/13 IIa (10 IIaA15G2R1, 2 IIaA16G3R1) and 1/13 IId (IIdA15G1) subtype/subgenotypes of C. parvum.According to the,The result of this study should that the distribution of Cryptosporidium species is high in Kars region. The high prevalance of zoonotic IIaA15G2R1 subtype/subgenotypes of C. parvum may possess thread to human health as well.