Kestane (Castanea sativa) tohumundan lipaz enziminin saflaştırılması ve kinetik özelliklerinin incelenmesi

Abstract

Bu çalışmada, ülkemizde Giresun İli ve çevresinde bol miktarda yetişen kestane (Castanea sativa) tohumlarından lipaz enzimi ilk defa saflaştırıldı ve kinetik özellikleri incelendi. Petrol eteri ile yağı uzaklaştırılmış kestane tohumları 0.06 M sodyum fosfat tamponu (pH=7.0) ile homojenize edildi. Lipaz esteraz aktivitesi gösteren homojenizatın %90'lık (NH4)2SO4 kesiti elde edildi. Dializden sonra bu kesit sırasıyla hidroksiapatit ve DEAE-selüloz kolonlara uygulanarak lipaz enzimi 186.87 kez saflaştırıldı. Saflaştırma işlemlerinde protein miktarı Lowry ve E280/E260 Warburg yöntemlerine göre, lipaz esteraz aktivitesi ise Erlanson yöntemine göre tayin edildi. Saflaştırılan enzimin SDS-PAGE elektroforezi sonucunda molekül ağırlığının 30 kDa olduğu bulundu. Optimum pH ve sıcaklık değerleri, pH ve sıcaklık stabiliteleri, optimum reaksiyon süresinin tayini, uygun enzim ve substrat konsantrasyonu belirlendi. Kestane tohumlarından saflaştırılan lipazın optimum pH'sının 9.0, optimum sıcaklığının 30°C olduğu bulundu. Enzimin çeşitli substratlara karşı ilgisi incelendiğinde, lipazın ilgisinin en çok p-nitrofenil miristada olduğu ve bu substrata karşı Km ve Vmax değerlerinin sırasıyla 1.017 mM ve 163.874 Ünite olduğu saptandı.Anahtar Kelimeler: Kestane (Castanea sativa) Tohumu, Lipaz, Saflaştırma, Karakterizasyon.

In this study, lipase was firstly purified from chestnut (Castanea sativa) seeds, beingabundant in Giresun (Turkey) and surroundings and the kinetic properties of the enzyme were investigated. Chestnut seeds, being fat-free with petroleum ether extraction, were homogenized with 0.06 M sodium phosphate buffer (pH=7.0) 90% of (NH4)2SO4 fraction of lipase esterase activity homogenate was obtained. After dialysis, this fraction was applied respectively to hydroxyapatite and DEAE-cellulose columns, and lipase was purified 186.87 times. In the purification process, the protein content was determined by using Lowry and E280/E260 Warburg methods, and lipase esterase activtiy was assayed with Erlanson's method. The purified enzyme, which showed SDS-PAGE, had a molecular weight of 30 kDa.The optimum pH and temperature values, pH and temperature stabilities, optimum reaction time, appropriate concentrations of the enzyme and substrate were investigated. It was also found that the lipase purified from chestnut seeds had an optimum pH value of 9.0 and an optimum temperature of 30C.When high affinity for various substrates of the enzyme is analyzed, it was found that most of the lipase of interest in myristate and 1.017, respectively p-nitrophenyl is the Km and Vmax values against the substrate unit is mm and 163.874.Key Words: Chestnut (Castanea Sativa) Seed, Lipase, Purification, Characterization.