The gene knock-out in N. benthamiana L. and P. somniferum L. by using RNA-guided CRISPR/Cas9 system

Abstract

Bitki genom modifikasyonları antik çağlardaki çifçilerin zamanından başlayarak günümüzün bilim insanları tarafından da klasik ıslah ve GM teknikleri uygulanarak insanlık tarafından yüzyıllardan beri yapılmaktadır. Şimdilerde, transkripsiyonel seviyedeki manipulasyonlar için sentetik yeni bir non-GM teknoloji geliştirildi. CRISPR sistemi, RNA kılavuzlu transiyent bir genom düzenleme aracıdır. Hedef spesifik olarak dizayn edilmiş bir kimerik sgRNA ve Cas9 endonükleazından oluşmakta olup, DNA da çift zincir kırıkları (DSB) oluşturarak genomda istenilen gen yada genlerde çerçeve kayması mutasyonu ile gen nakavtı yapar. CRISPR sistemi, DNA da kırık oluşumuna sebep olduktan sonra, bitkinin kendi tamir mekanizmaları olan HR ve NHEJ mekanizmalarını devreye sokar. Tip II CRISPR/SpCas9, yüksek oranda spesifik ve güvenilir bir sistem olup, bitki çalışmalarına adapte edilmiş diğer genom düzenleme teknolojileri arasındaki en uç teknolojidir. Bu çalışmada, en popüler tıbbi aromatik bitkilerden biri olan haşhaş (Papaver somniferum L.), ve iyi bilinen bir model organizma olan Nicotina benthamiana L.'nın genomları viral ve sentetik tabanlı olarak transkribe olan sgRNA ler kullanılarak CRISPR/Cas9 sisteminin uygulanabilirliği açısından incelenmiştir. Pap4OMT2 ve NbPDS genlerisini hedefleyen sgRNA ler spesifik olarak dizayn edilmiş ve SpCas9 endonükleaz ile beraber istenilen gen segmentleri hedeflenmiş olup oluşan InDel ler gösterilmiştir. Böylece, CRISPR/Cas9 sisteminin model olmayan Papaver türlerinde uygulanabilirliği literatürde ilk kez gösterilmiştir.

Genome modifications in plants have been doing for many centuries by mankind since from the times of ancient farmers to the scientists for now by applying selective breeding and GM techniques. Recently, a new synthetic non-GM technology has been developed for transcriptional-level manipulations. CRISPR system is an RNA-guided transient genome editing tool, that is generally composed of a target-specifically designed chimeric sgRNA and a Cas9 endonuclease, which forms DSBs in DNA and results a frame-shift mutation to knock-out any desired gene or genes in genome. CRISPR system employs genome repair mechanims of HR or NHEJ after introducing a cut into DNA and mediates genome editing by using organisms own repair mechanisms. Type II CRISPR/SpCas9 is a highly-specific and robust system which is a state of art among the other genome-editing technologies that is adapted to plant sicence. In this study, Opium poppy (Papaver somniferum L.), one of the most popular medicinal aromatic plants, and a well-known model organism Nicotina benthamiana L. genomes were investigated on the applicabilitiy of CRISPR/Cas9 system by using synthetic and viral based transcribed sgRNAs. sgRNAs targeting Pap4OMT2 and NbPDS genes were specifically designed and used to target those specific gene segments with SpCas9 endonuclease and formed InDels were demonstrated. Thus, the applicability of CRISPR/Cas9 system in non-model papaver species was shown for the first time in literature.