Identification of candidate substrates of SIK2 in vitro

Abstract

SIK2, gen anlatımı sıçan retinasında yaygın görülen bir serin/threonin kinazdır ve FGFsinyal yolağında potansiyel bir regülatör olduğu savlanmaktadır.Bu çalışmanın amacı; SIK2 ile FGF/ERK sinyal yolağı arasındaki bağı araştırmaktır. Bubağlamda, üç aday SIK2 sübstratı, Gab1, Grb2 ve A-Raf bu yolakta yer alıp, aynı zamandaSIK2'ye özgü fosforlama motifini içeren proteinler olarak biyoenformatik yöntemlebelirlenmiştir. Bu araştırma kapsamında, FRS2 ve Shc1 proteinleri bu motifi içermemelerinekarşın, FGF sinyal yolağında önerilen regülatör rolleri ve çok sayıda fosforlanabilirserin/threonin aminoasitleri nedeniyle irdelenmişlerdir. Belirlenen adaylar GST füzyonproteinleri olarak bakteride üretilmiş, afinite kolonlarından geçirilerek saflaştırılmıştır. Buproteinlerin sübstrat olma potansiyelleri SIK2 ile in vitro kinaz yöntemi kullanılarak analizedilmiştir.Sonuçlarımız, FGF sinyal yolak elemanlarından Gab1 ve A-Raf proteinlerinin SIK2 ilefosforlanabileceğini göstermektedir, buna karşılık Grb2, FRS2 ve Shc1 proteinlerinin SIK2tarafından fosforlanmadığına işaret etmektedir. Bu proteinler FGF/ERK sinyal yolağında anarollere sahiptir, ERK aktivitesinin süresi ve düzeyini belirler. ERK aktivitesinin süresi bazıhücre tiplerinde çoğalma ve farklılaşma cevaplarının belirleyici faktörü olarak ilerisürülmektedir. Verilerimiz, SIK2 tarafından tanımlanan bu proteinlerin fosforlanmadurumlarının ERK aktivitesinin düzeyini ve sürekliliğini in vivo düzenleme, dolayısıylaSIK2'nin büyüme faktörü uyarımı sonucu çoğalma veya farlılaşma kararlarına neden olanolayların bir parçası olma olasılığını gündeme getirmektedir.

SIK2 is a serine/threonine kinase widely expressed in rat retina and it is postulated to bea potential regulator of FGF signal transduction in retina.The aim of this work is to explore a link between SIK2 and FGF/ERK pathway. In thiscontext, three novel candidate SIK2 substrates, Gab1, Grb2 and ARaf that involved in thispathway and have consensus SIK2 phosphorylation motifs were identified by bioinformaticstools. Even though the search found no canonical SIK2 phosphorylation motif on Frs2 andShc1 proteins, these were included in this study, because of their proposed regulatory roles inFGF signal transduction pathway and by having numerous potentially phosphorylatable serineand threonine residues. Subsequently, these candidates were expressed in bacteria as GSTfusion proteins, purified through affinity columns and their phosphorylation by SIK2 wasassayed using radioactively labeled ATP in vitro.We have shown two components of FGF signal pathway, Gab1 and A-Raf, that can bephosphorylated by SIK2 in vitro. These proteins are proposed to have major roles inFGF/ERK pathway, determining the level and duration of ERK activity. The duration of ERKactivity (transient or sustained) suggested to be a determining factor in proliferation ordifferentiation responses in some cell types. It is conceivable that the phosphorylation status ofthese proteins defined by SIK2 may fine-tune the levels and duration of ERK activity, thusSIK2 may be a component of the events leading to proliferation versus differentiationdecisions upon growth factor stimulation.