Yönlendirilmiş fiber yapıya sahip bakteriyel selüloz esaslı kompozitler kullanılarak çok fazlı osteokondral doku iskelesi üretimi

Abstract

Osteokondral defekt travma, yaşlılık ve osteoartrit gibi hastalıkların neden olduğu eklem kıkırdağı ve altındaki kemik dokusunda meydana gelen ve ortopedik cerrahide tedavisi hala tam olarak gerçekleştirilemeyen, günden güne daha da yaygınlaşan bir sorundur. Osteokondral defektlerin onarımı için günümüzde kullanılan klinik tedavi yöntemleri geçici çözümler sunmaktadır. Doku mühendisliği uygulamaları osteokondral defektlerin iyi bir şekilde onarılması ve tedavinin uzun süreli kalıcığı için alternatifler sunmaktadır. Osteokondral defektlerin başarılı şekilde onarılabilmesi için tasarlanacak doku iskelelerinde kıkırdak, kalsifiye kıkırdak ve kemik ara yüzünün sahip olduğu mikro çevreyi taklit edebilen iskelenin oluşturulması önemlidir. Osteokondral dokudaki kıkırdağın yüzey, orta ve derin katmanları ile kalsifiye kıkırdak katmanının hücre dışı matris ve nanofiber düzenlenişleri ve dolayısı ile mekanik özellikleri ile hücre morfolojileri de farklıdır.Bu tez, kemik ve kıkırdağın mikroçevresinin farklı kimyasal modifikasyonlarla taklit edildiği, farklı nanolif yönelimlerine sahip çok fazlı hücresiz osteokondral doku iskelesi üretmeyi amaçlamaktadır.Çalışmalarımızda Gluconacetobacter xylinus tarafından sentezlenen bakteriyel selüloz (BS), karmaşık nanofiber yapısına sahip iskele için parçalanarak, yüzeye paralel ve dik yapıya sahip iskele için ise membran şeklinde kullanılmıştır. Membran BS'nin karmaşık nanofiber yapısı geliştirdiğimiz bir aparat kullanılarak nanofiber yönlendirmesi %73,4 oranıyla 30˚'nin altında olması sağlanmıştır. Biyobozunurluk için yapılan sodyum periyodat oksidasyonunun optimizasyonu ile bütünlüğünü koruyabilen iskelenin 0.05 M sodyum periyodat ve 30 dk oksidasyon süresi ile 45 gün sonunda yaklaşık %9 bozunma elde edilmiştir. Parçalanmış BS ile hazırlanan ve kıkırdak için kitosan ile modifiye edilen iskelenin por çapı 100-150 µm, kemik için HAp ile modifiye edilen iskelenin por çapının ise 160-285 µm aralığında olduğu belirlenmiştir. Kıkırdak katman için kitosan (%0.1-0.5) ve glikozaminoglikan (GAG)(%10) (kondroitin sülfat), kemik katman için hidroksiapatit ve bor (%0.01-0.05) ve kalsifiye kıkırdak katman için kitosan, GAG (%10) ve kalsiyum klorür ile modifiye edilen iskelelerin karakterizasyon testleri (Taramalı Elektron Mikroskobu, Enerji Dağılımlı Spektrometre, Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi, X-Ray Fotoelektron Spektroskopisi) ve ayrıca kıkırdak ve kalsifiye kıkırdak doku iskeleleri için Dimetilmetilen Mavisi Testi (DMMB) Boyama, kantitatif GAG tayini, kemik doku iskelesi için Alkalen fosfataz testi ve Alizarin Red S boyama ile modifikasyonlar doğrulanmıştır. Ardından hücre canlılığı ve hücre farklılaşması çalışmaları sonucu kıkırdak için BS-Kitosan0.5-GAG ve kemik için BS-HAp-B0.01 doku iskelelerinin en iyi sonuçları verdiği belirlenmiştir. Osteokondral yapıyı oluşturacak katmanların statik basma testi sonuçları; BS-HAp-B0.01 için 293 kPa, BS-Kitosan0.5-GAG için 260 kPa, kalsifiye kıkırdak için 855 kPa olarak belirlenmiştir. Membran ve parçalanmış BS katmanının bir araya getirildiği doku iskelerindeki soyulma testi sonucu ise 41.04 mPa olarak belirlenmiştir. Sonuç olarak fiziksel ve kimyasal modifikasyonlarla kemik ve kıkırdak mikro çevresinin taklit edildiği BS esaslı beş katmanlı hücresiz doku iskelesi üretilmiştir.

The osteochondral defect is an increasingly common problem in the articular cartilage and underlying bone tissue caused by trauma, old age and osteoarthritis. It is still not fully treated in orthopaedic surgery. Current clinical treatment methods for the repair of osteochondral defects offer temporary solutions. Tissue engineering applications offer alternatives for good repair of osteochondral defects and long-term durability of the treatment. It is essential to design scaffolds to successfully repair osteochondral defects, which can mimic the microenvironment of cartilage, calcified cartilage and bone interface in tissue scaffolds. The surface, middle, deep and calcified cartilage layers of osteochondral tissue have different extracellular matrix and nanofiber arrangements and, therefore, different mechanical properties and cell morphologies.This thesis aims to produce a multiphase cell-free osteochondral scaffold with different nanofiber orientations in which different physical and chemical modifications mimic the microenvironment of bone and cartilage.In our studies, bacterial cellulose (BS) synthesized by Gluconacetobacter xylinus was disintegrated for scaffolds with complex nanofiber structures and membrane BS was used for scaffolds with parallel and perpendicular structures to the surface. The complex nanofiber structure of the membrane BS was ensured to be below 30˚ with a nanofiber orientation of 73.4% by using an apparatus we developed. After optimizing sodium periodate oxidation for biodegradability, approximately 9% degradation was obtained at the end of 45 days with 0.05 M sodium periodate and 30 min oxidation time. It was determined that the pore diameter of the scaffolds prepared with shredded BS and modified with chitosan for cartilage was 100-150 µm, and the pore diameter of the scaffolds modified with HAp for bone was between 160-285 µm. The characterization tests of scaffolds modified with chitosan (0.1-0.5%) and glycosaminoglycan (GAG) (10%) for cartilage layer, hydroxyapatite and boron (0.01-0.05%) for bone layer, and chitosan, GAG, and calcium chloride for calcified cartilage layer were confirmed using Scanning Electron Microscopy, Energy Dispersive Spectrometry, Fourier Transform Infrared Spectroscopy, and X-Ray Photoelectron Spectroscopy. Additionally, Dimethylmethylene Blue Test (DMMB) staining was performed for the quantitative determination of GAG content in cartilage and calcified cartilage tissue scaffolds and Alkaline Phosphatase testing and Alizarin Red S staining for HAp in bone tissue scaffolds. Then, as a result of cell viability and cell differentiation studies, it was determined that BS-Kitosan0.5-GAG for cartilage and BS-HAp-B0.01 for bone gave the best results. Static compression test results of the layers that will form the osteochondral structure; It was determined as 293 kPa for BS-HAp-B0.01, 260 kPa for BS-Chitosan0.5-GAG, and 855 kPa for calcified cartilage. The peel test result on tissue scaffolds consisting of membrane and shredded BS layers was 41.04 mPa. As a result, a BS-based five-layer cell-free tissue scaffold was produced, in which the bone and cartilage microenvironment was simulated with physical and chemical modifications. As a result, a BS-based five-layer cell-free tissue scaffold was produced in which the layers and nanofiber orientations in osteochondral tissue were mimicked to differentiate cells in the tissue.