Doğu Karadeniz bölgesinde yayılış gösteren bazı Betula spp. endofitlerinin betülin biyotransformasyon ve tirozinaz inhibisyon kapasitelerinin araştırılması

Abstract

Bir betülin türevi olan, betülinik asit (BA), lupan iskeletine sahip pentasiklik triterpen yapılı doğal bir üründür. Antiviral, antimikrobiyal, anti-inflamatuar gibi geniş spektrumda biyoaktivite göstermesine rağmen en büyük ilgiyi antitümör ajanı olarak görmektedir. Bu nedenle sağlık, gıda, kozmetik gibi alanlarda BA'ya olan ihtiyaç her geçen gün artmaktadır. BA, başlıca huş ağacı (Betula spp.) kabukları olmak üzere çeşitli bitki kaynaklarından ekstraksiyon ile elde edilmektedir. Fakat bu kaynaklardaki miktarı düşüktür. BA'nın elde edildiği diğer bir yöntem ise betülinden yarı-sentez ile kimyasal üretimidir. Fakat bu yöntemin sert reaksiyon koşullarında gerçekleşmesi ve toksik kimyasalların kullanılması gibi dezavantajlarından dolayı yöntem çevre dostu değildir. Bu nedenlerden dolayı artan BA ihtiyacını karşılayacak alternatif, çevre dostu yöntemlerin geliştirilmesi önemlidir. Bu kapsamda, betülinin BA'ya mikrobiyal transformasyonu son yıllarda ilgi görmektedir. Fakat biyotransformasyon çalışmalarının en önemli handikaplarından biri, istenilen transformasyon reaksiyonu için uygun mikroorganizmanın bulunmasıdır ve bunun için çeşitli mikroorganizmaların taranması yaygın bir yöntemdir. Betülin, huş ağaçlarının dış kabuklarında bol miktarda bulunmasına ve bu bitkilerden elde edilmesine rağmen, Betula spp. endofitleri betülinin BA'ya biyotransformasyonu için daha önce araştırılmamıştır. Endofitler, konakçı bir bitkinin sağlıklı dokularındaki hücreler arasında ve/veya hücre içinde yaşayan mikroorganizmalardır ve endofitlerin konakçı ile uzun süreli simbiyotik ilişkisi bu organizmalara bitkinin sentezlediği kimyasalları transformasyona uğratma yeteneği kazandırabilmektedir. Bunların yanı sıra, betülinin biyotransformasyonu sonucu daha biyoaktif metabolitler sentezlenebilmektedir. Meyve ve sebzelerde enzimatik esmerleşmeye, ciltte hiperpigmentasyona neden olan melanin sentezinde önemli bir enzim olan tirozinazın inhibisyonundan sorumlu bileşiklere sağlık, kozmetik, gıda gibi sektörlerde ihtiyaç duyulmaktadır. Çeşitli bitkilerden ekstrakte edilen BA'nın anti-tirozinaz aktitivitesi rapor edilmesine rağmen betülin biyotransformasyonu sonucu potansiyel yeni tirozinaz inhibitörlerinin araştırılmasına yönelik bir çalışma bulunmamaktadır. Bu bilgiler ışığında tez kapsamında, Doğu Karadeniz Bölgesinde yayılış gösteren Betula pubescens var. litwinowii (Doluch.) Ashburner & McAll'ın kök, gövde ve dal kısımlarından endofitik mikroorganizmaların izolasyonu ve tanımlanması, endofitlerin betülini BA'ya biyotransformasyon kapasitelerinin araştırılması ve biyotransformasyon ortamlarından elde edilen ekstrelerin anti-tirozinaz aktivitelerinin tayini amaçlanmıştır. Bu kapsamda yüzey sterilizasyonu yapılmış bitki örneklerinden izole edilen 11 adet bakteri ve 26 adet fungus izolatı polifazik yaklaşımla tanımlanmış ve farklı biyotransformasyon koşullarında betülini BA'ya biyotransformasyon kapasiteleri taranmıştır. Sıvı-sıvı ekstraksiyonu ile biyotransformasyon ortamlarından elde edilen ekstreler, betülin ve BA'nın kantitatif tayini için RP-HPLC ile analizlenmiştir. RPB2 gen bölgesi analizine göre Fusarium lacertarum olarak tanımlanan F59 kodlu endofitin biyotransformasyon yoluyla BA ürettiği bulunmuştur. En yüksek BA üretimi (80.85±2.64 µg/ml), fungusların biyotransformasyon öncesi aktivasyon besiyerinde betüline aklimatize edildiği ve proses süresince tüm besiyerlerinde karbon kaynağı olarak glukoz yerine gliserolün kullanıldığı Fungal Biyotransformason Prosesi-2 koşullarında elde edilmiştir. Ayrıca biyotransformasyon ortamlarından elde edilen ekstrelerin tirozinaz inhibisyon aktiviteleri ince tabaka kromatografisi biyo-otografi yöntemi ile taranmış ve JustTLC görüntü analiz programı ile kantitatif tayinleri yapılmıştır. Denemeler sonucu anti-tirozinaz aktiviteye sahip 6 ekstre ve bu ekstrelerde inhibisyondan sorumlu farklı alıkonma faktörüne sahip 5 fraksiyon tespit edilmiştir. Özetle, tez kapsamında B. pubescens var. litwinowii (Doluch.) Ashburner & McAll'ın endofitleri ilk defa araştırılmış ve ülkemizin biyoçeşitlilik envanterine katkı sağlamıştır. Betula spp. endofitleri, betülinin BA'ya biyotransformasyonu amacıyla ilk kez araştırılmış ve Fusarium genusuna ait bir türün betülin biyotransformasyonu yoluyla BA ürettiği ilk kez bulunmuştur. Son olarak, ekstrelerde tespit edilen anti-tirozinaz aktiviteye sahip fraksiyonlar, potansiyel yeni moleküllerin keşfedilmesi açısından umut vadetmektedir ve Rhodococcus qingshengii'nin (B424) tirozinaz inhibisyon aktivitesi ilk defa rapor edilmektedir.

Betulinic acid (BA), a derivative of betulin, is a natural product with a lupane type pentacyclic triterpene structure. Although it has a wide spectrum of bioactivity such as antiviral, antimicrobial, anti-inflammatory, it attracts great attention as an antitumor agent. Thus, the demand for BA has been increasing in the areas of health, food and cosmetics. BA is obtained by extraction from various plant sources, mainly birch barks (Betula spp.). However, the amount in these sources is low. Another approach to obtain BA is semi-synthesis from betulin. However, this method also has some disadvantages such as harsh reaction conditions, toxic chemicals being used which makes it eco-unfriendly. For these reasons, it is important to develop alternative, environmentally friendly methods to meet the increasing demand for BA. From this point of view, the microbial transformation of betulin to BA has attracted attention in recent years. However, one of the obstacle in biotransformation studies is to find an appropriate microorganism for desired transformation process and screening of a variety of microorganisms is common method for this. Even though betulin is abundant in the outer barks of birches and obtained from these plants, endophytes of Betula spp. have not been investigated for biotransformation of betulin to BA before. Endophytes are microorganisms which live inter- and/or intra-cellularly inside the healthy tissues of a host plant and the long-term symbiotic relationship of endophytes with the host plant might be gained these organisms the capability to transform the plant associated chemicals. In addition to these, more bioactive metabolites can be synthesized as a result of biotransformation of betulin. There is need for the compounds responsible for the inhibition of tyrosinase, an important enzyme in the synthesis of melanin causing enzymatic browning of fruits and vegetables, hyperpigmentation of the skin, in the sectors such as health, cosmetics and food. Although the anti-tyrosinase activity of BA extracted from various plants has been reported, there is no study investigating potential new tyrosinase inhibitors as a result of the betulin biotransformation. In the light of these facts, in the thesis, it was aimed to isolate and identify endophyte microorganisms from roots, stems and branches of Betula pubescens var. litwinowii (Doluch.) Ashburner & McAll distributed across the Eastern Black Sea Region, to investigate the betulin biotransformation capabilities of endophytes to BA and to determine the anti-tyrosinase activities of the extracts obtained from biotransformation media. In the scope of this, 11 bacterial and 26 fungal endophytes, isolated from surface sterilized plant samples, were identified by polyphasic approach and their biotransformation capabilities of betulin to BA were screened under different biotransformation conditions. The extracts obtained from the biotransformation media by liquid-liquid extraction were analyzed by RP-HPLC for quantitave determination of betulin and betulinic acid. It was found that the F59 encoded endophyte, which was identified as Fusarium lacertarum according to the RPB2 gene analysis, produced BA through biotransformation. The highest BA production (80.85±2.64 µg/ml) was obtained under Fungal Biotransformation Process-2 conditions where fungi were acclimatized to betulin in activation media before biotransformation and glycerol was used instead of glucose as carbon source in all media during the process. In addition, tyrosinase inhibition activities of the extracts obtained from biotransformation media were screened by thin layer chromatography bio-autography method and quantitative determinations were made by JustTLC image analysis software. 6 extracts with anti-tyrosinase activities and 5 fractions with different retention factors responsible for inhibition were determined in these extracts. In summary, within the scope of the thesis, endophytes of B. pubescens var. litwinowii (Doluch.) Ashburner & McAll were investigated for the first time and contributed to the biodiversity inventory of our country. Betula spp. endophytes were investigated for the first time for biotransformation of betulin to BA and it is the first time that a species belonging to the genus Fusarium has been found to produce BA through betulin biotransformation. Finally, the fractions with anti-tyrosinase activity detected in the extracts are promising for the discovery of potential new molecules. The tyrosinase inhibiton activity of Rhodococcus qingshengii (B424) is reported for the first time.