HbA1c'nin Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (LC-MS) ile saptanması ve optimizasyonu

Abstract

nsan kanındaki glikozile hemoglobinlerin majör formu olan HbA1c (b-N-1-deoksifruktozil-hemoglobin), HbA0'ın b-zincirinin N-terminal amino grubunaglukozun baglanmasıyla olusur. Glikozile hemoglobin ölçümü, DM'de orta veuzun dönem glisemik kontrolün izlenmesi ve diyabet hastalarında diyabetikkomplikasyonların gelisme riskinin degerlendirilmesinde sıklıklakullanılmaktadır. DCCT (Diyabet Kontrolü ve Komplikasyonları Çalısması) veUKPDS (ngiltere Prospektif Diyabet Çalısması) sonucu kandaHbA1c/glikozile hemoglobin ölçümü diyabetik hastaların glisemik durumununuzun dönem kontrolünde altın standart olarak kabul edilmistir. Kliniklaboratuvarlarda HbA1c ölçümünde iyon degisim ve afinite kromatografisi,elektroforez ve immunolojik prensibe dayalı 15'ten fazla farklı yöntemkullanılmaktadır. Uygun bir analitik teknik arastırılırken iki analitik yaklasımgelistirilmistir: HPLC-ESI-MS (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi-Elektrospray yonizasyon-Kütle Spektrometresi) ve HPLC-CE (HPLC-KapillerElektroforez). Her iki yöntemde çok iyi çalısmaktadır ve benzer sonuçlarvermektedir.IFCC referans HbA1c ölçüm yöntemi, hemoglobinin b-zincirinin endoproteinazGlu-C ile kesilmesi sonrası olusan glikozile hekzapeptidlerin glikozileolmayan hekzapeptidlere oranlanması temeline dayanmaktadır. LC-ESI-MSözellikle hemoglobinin b zincirinin N-terminal ucundaki glikozilasyonu ölçtügüiçin HbA1c'nin tam ölçümünü saglamaktadır. Bu çalısmada, LC-ESI-MSkullanarak hemoglobinin b-zincirinin N-terminal kalıtının spesifikbelirlenmesine dayalı orijinal IFCC referans HbA1c ölçüm yöntemi modifiyeedilmistir. HbA0 ve HbA1c'nin b-N-terminal oktapeptidlerini olusturmak içinintakt hemoglobin molekülünün tripsinle enzimatik yıkımı gerçeklestirildiktensonra olusan bu peptidler LC ile ayrılıp, ESI-MS ile miktar tayini yapılmıstır.HPLC ile HbA1c düzeyleri belirlenmis 34 kan örneginin LC-ESI-MS yöntemiyleHbA1c miktarları ölçülmüstür. LC-ESI-MS ile HbA1c ölçümü 3 dakikadagerçeklestirilmistir. Ölçüm sonuçlarının HPLC'ye göre daha düsük oldugubulunmustur. Hemoglobinin tripsinle kesilmesi sonrası HbA1c ölçümü yapanLC-ESI-MS yöntemi ile HPLC arasındaki korelasyonun iyi oldugugözlenmistir. Her iki yöntemle elde edilen veriler arasındaki korelasyonDeming regresyon analizi yapılarak belirlenmis, korelasyon katsayısı 0.980,egim 0.779 (%95 CI: 0.741?0.818) ve intercept 0.52 (95% CI: 0.28?0.76)olarak hesaplanmıstır. Bias egrisinden tripsinle kesim yönteminin %1 bias'asahip oldugu saptanmıstır.Bu özel kosullar altındaki mevcut yöntemle günler arası ve gün içitekrarlanabilirlik için varyasyon katsayıları (CV) sırasıyla %3.8 ve %1.6 olarakbulunmustur (n=10). Bu yöntemle referans ölçüm yönteminden daha yükseksinyal yogunlugu ve iyilesmis sistem stabilitesi elde edilmistir.IFCC yönteminden modifiye ettigimiz bu yöntem insan kanındaki HbA1c'ninölçümü için mevcut IFCC referans yöntemine alternatif olarak kullanılabilir.Anahtar Kelimeler: HbA1c, LC-MS, Diabetes Mellitus

HbA1c (b-N-1-deoxyfructosyl-hemoglobin) is the major form of all glycosylatedhemoglobin species in human blood and is defined as the stable adduct ofglucose and the N-terminal amino group of the b-chain of hemoglobin A0.The measurement of glycosylated hemoglobin is frequently used in diabetesmanagement to monitor mid to long-term glycemic control and to assess therisk of development of diabetic complications in patients with diabetes. Themeasurement of HbA1c (glycosylated hemoglobin) in blood has become thegold standard for the long-term control of the glycemic state of diabeticpatients as presented in the DCCT and UKPDS studies. More than 15different analytical methods are currently used by the clinical laboratories,which are based on ion exchange or affinity chromatography, electrophoresisand immunological principles. Searching for an appropriate analyticaltechnique, two analytical approaches have been proven to be adequatelysuited namely HPLC-Electrospray Ionisation-Mass Spectrometry (HPLC-ESI--MS) and HPLC-Capillary Electrophoresis (HPLC-CE). Both principles workvery well and generate identical results.The IFCC reference measurement procedure for HbA1c is based on the ratioof glycosylated to non glycosylated N-terminal hexapeptides of the b-chainsof hemoglobin after digestion with Glu-C endoproteinase. ESI-MS provides aprecise measurement of HbA1c and, in particular, glycation of the N-terminalend of hemoglobin b chain. In this study, we modified the original IFCCreference HbA1c measurement procedure utilizing LC-ESI-MS which methodbased on determination of the specific N-terminal residue of the hemoglobinb-chain. Enzymatic cleavage of the intact hemoglobin molecule with trypsinhas been optimized to obtain the b-N-terminal octapeptides of Hb moleculesrepresenting the HbA1c and HbA0. These peptides have been separated byLC and quantitated with Electrospray Ionization-Mass Spectrometry. HbA1clevel of 34 blood samples was measured by HPLC and LC-ESI-MS. Result ofHbA1c measurement by ESI-MS is available within 3 min. The results ofHbA1c measured by ESI-MS on 34 blood samples were lower than by HPLC.In the under the specific conditions, between-run and within-run CVs of thepresent method is found as 3.8% and 1.6%; respectively (n =10). Using thismethod, we obtained higher signal intensities and improved system stabilitycompared with the reference measurement procedure.The comparison between the HPLC and LC-MS determination of trypsincleaved hemoglobin methods for HbA1c determination demonstrate goodcorrelations. A close correlation between both HPLC and LC-ESI-MS methoddata sets were obtained by using Deming regression analysis, with acorrelation coefficient of 0.980 and a slope of 0.779 (95% CI: 0.741?0.818)with an intercept of 0.52 (95% CI: 0.28?0.76); indicating a constant biasbetween both methods. The bias plot shows a significant bias of 1% HbA1c ofthe trypsin digestion method. The currently modified IFCC method issuggested to be an alternative for the existing IFCC reference measurementprocedure for the determination of HbA1c in human blood.Key words: HbA1c, LC-MS, Diabetes Mellitus