Türk toplumunda Ege bölgesinde EGFR ve ALK mutasyonu ve klinikopatololojik özellliklerin korelasyonu

Abstract

Giriş ve Amaç: Bu araştırmada Türk toplumunda Ege Bölgesi'nde yaşayanKHDAK hastalarında EGFR ekzon 18, 19, 20, 21 ekzon mutasyonları ve ALKanalizi ile klinikopatolojik özellikleri ve prognozun kıyaslanması amaçlanmıştır.Hastalar ve Yöntem: EGFR ekzon 18,19,20 ve 21 mutasyonları hastalara aitparafin bloklardan (her hasta için yaklaşık 5 µ büyüklüğünden en az 3 kesit) alınanörneklerden `QIAamp DNA FFPE Tissue kit` (Qiagen, ABD) kullanılarak her birreaksiyon tüpü başına 15-20 ng olacak şekilde DNA izolasyonu yapıldı. Elde edilenörnekler ile Rotor Gene sistemi kullanılarak RT-PCR aşaması gerçekleştirildi.Mutasyon saptama aşamasında her bir örnek için EGFR G719x, EGFR T790M,EGFR S768I, EGFR ex20ins, EGFR L858R, EGFR L861Q, EGFR ex19del veEGFR ctrl olmak üzere 8 farklı karışım çoğaltıldı. RT-PCR aşaması Rotor genesistemi ile gerçekleştirildi. Analiz aşamasında değerlendirme kit içeriğinde yazdığışekilde ΔCt değerleri hesaplanarak üretici firmanın önerilerine göre gerçekleştirildi.ALK için ise Tümörün parafin bloğundan 4-5 mikronluk kesitler alınıpMikroskopta dual filtreyle bakıldığında yeniden düzenlenme olmayan nükleuslardayan yana yeşil ve kırmızı sinyal veya üst üste binmiş sarı görünen yakın sinyallerizlenir. Eğer birbirinden ayrı yeşil- kırmızı sinyallerin `break apart` ve tek kırmızısinyallerin oranı %15'in üzerindeyse ALK rearrangement'ı pozitif kabul edildi.EGFR ve ALK mutasyon durumu ile klinikopatolojik özellikleri veprognozu analiz edilmiştir.Sonuçlar: 593 hastadan 63 hastada (%10.6) EGFR mutasyonu saptanmıştır.Mutasyonların dağılımı 2 hastada ekzon 18, 34 hastada ekzon 19, 3 hastada ekzon X20, 24 hastada ekzon 21 olarak görülmüştür. EGFR mutasyonu olan 63 hastanın 36 sıkadın (%57,14) oranında bulunmuştur, tüm çalışmaya katılan hastaların %21, 6 sınınkadın olduğu göz önünde bulundurularak anlamlı fark olduğu görülmüştür(P=0,086). Bizim çalışmamızda mutasyonu olmayan grupta sigara içme yüzdesi%95,5 iken, EGFR mutasyonu olan hastalar arasında ise %11,1 de kalarak anlamlıbir fark olduğu, yani sigara öyküsü ile EGFR mutasyonu arasında negatif korelasyonvarlığı saptanmıştır(P=0.005). EGFR mutasyonu ile metastatik bölgeler ve nüksarasında ilişki saptanmamıştır.Yine 593 hasta arasında 19 hastada(%3,2) ALK mutasyonu olduğugörülmüştür. ALK mutasyonu olan 19 hastanın 8 i erkek (%42,1) oranındabulunmuştur. Bizim çalışmamızda mutasyonu olmayan grupta sigara içme yüzdesi%95,5 iken, ALK mutasyonu olan hastalar arasında ise %33,3 de kalarak anlamlı birfark olduğu, yani sigara içmeyen hastalarda ALK mutasyonunun daha sık olduğugörülmüştür. ALK mutasyonu ile de mutasyonu olmayan veya EGFR mutasyonuolan hastalar arasında metastatik bölgeler veya nüks açısından herhangi bir farkgörülmemiştir.Tartışma: Ülkemizde Ege bölgesinde referans göğüs hastalıkları eğitimaraştırma hastansinde yapılan çalışmamızda EGFR mutasyon pozitifliği ve ALKmutasyonu pozitifliği Avrupa beyaz ırk ile benzer oranlarda tesbit edildi. EGFRmutasyonu kadın, sigara içmeyenlerde ve adenokarsinom histolojisinde daha sıktır.ALK mutasyonu da çalışmamıza göre aynı şekilde genç yaşta, kadınlarda ve sigaraiçmeyenlerde daha sık saptanmıştır. EGFR ve ALK mutasyonu olan hastalarmutasyonu olmayanlara göre daha iyi prognoza sahiptir. Sonuçta seçilmiş hastalardahedefe yönelik tedaviler belirgin yaşam süresi avantajı sağlamasıyla ilk hattanitibaren tedavide yerini almıştır.

Introduction and Purpose: In this study, it was aimed to compare clinicalfeatures and prognosis of EGFR exon 18, 19, 20, 21 exon mutations and ALKanalysis in NSCLC patients.Patients and Methods: EGFR exon 18, 19, 20 and 21 mutations were screenedusing the `QIAamp DNA FFPE Tissue kit` (Qiagen, USA) from samples takenfrom diseased paraffin blocks (at least 3 sections from approximately 5 μ size foreach patient) DNA isolation was performed as 15-20 ng per tube. For mutationscreening, `Easy EGFR` (Diatech, Italy) kit was used. For the first step of thestudy, the mixture was prepared by pipetting and spin-centrifuging to prepare 10 μLof Taq Premix 920, 4 μL of water and 1 μL of EGFR ctrl mix for each reaction forDNA control.Distribute 15 μl of the mixture to the reaction tubes and dispense 5 μl ofdistilled water for negative control and 5 μl of EGFR Pos for positive control. Ctrl IIand 5 μl of sample DNA for patients. RT-PCR steps were performed using the RotorGene system with the samples obtained. According to this, the samples with Ctvalues 20-31 in the green channel were taken to the second stage by considering theDNA quality as appropriate. Eight different mixtures of EGFR G719x, EGFRT790M, EGFR S768I, EGFR ex20ins, EGFR L858R, EGFR L861Q, EGFR ex19deland EGFR ctrl were amplified for each sample during the mutation detection step.Negative control distilled water and positive control EGFR Pos. Ctrl II was added towork. The RT-PCR step was performed with the Rotor gene system. In the analysisphase, the ΔCt values were calculated as described in the evaluation kit, and wereperformed according to the manufacturer's recommendations.XIIFor ALK, 4-5 micron sections were taken from the paraffin block and treatedwith different temperatures in the solutions in the special kits after the sections wereremoved with the oven, xylene and alcohol phases. In the so-called special hybridprobe, the DNA chain-stained probes were combined in the nucleus at the tissuesection waiting overnight with the probes, and then the preparations were closed withthe material to be washed and the nuclei for several hours. After the treatment, thepreparations were stored in the dark and minus cold. When viewed with a dual filterin the microscope, non-reoriented nuclei show adjacent green and red signals orclose-up yellow appearing in the nucleus. If more than 15% of the green-red signalsand the single red signals are separated from each other, the ALK rearrangement isconsidered positive.EGFR and ALK mutation status and clinicopathologic features and prognosiswere analyzed.Results: EGFR mutation was detected in 63 patients (10.6%) from 593patients. The distribution of mutations was exon 18 in 2 patients, exon 19 in 34patients, exon 20 in 3 patients and exon 21 in 24 patients. EGFR was found in 36patients (57.14%) of 63 patients with mutation and it was found that 21.6% of thepatients who participated in the study had a significant difference (P = 0.086). In ourstudy, there was a significant difference (95.5%) between smoking and non-mutationgroup and 11.1% among patients with EGFR mutation, ie negative correlationbetween smoking history and EGFR mutation (P = 0.005). There was no relationshipbetween EGFR mutation and metastatic regions and recurrence.Among the 593 patients, ALK mutation was found in 19 patients (3.2%).Eight of the 19 patients with ALK mutation were male (42.1%). In our study, thepercentage of smoking was 95.5% in the non-mutation group, while it was 33.3% inthe ALK mutation patients, meaning that the ALK mutation was more frequent innon-smokers. There was no difference in metastatic regions or recurrence betweenALK mutation and patients with no mutation or EGFR mutation.XIIIDiscussion: EGFR mutation is more frequent in women, non-smokers andadenocarcinoma histology. ALK mutation is also more frequent in young, womenand non-smokers, according to this study. Patients with EGFR and ALK mutationshave good prognosis. Targeted treatment should be used in selected patients.