Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz enziminin köpek karaciğerinden saflaştırılması ve bazı özelliklerinin tanımlanması

Abstract

ÖZET Köpek karaciğeri G6PD'ı, 2',5'-ADP - Sepharose affinite kolonu kullanılarak % 18 verim ve 130 U/mg proteinlik özgül aktivite ile saflaş tırıldı. Enzim, ikinci kez 2',5'-ADP Sepharose kolonundan geçirildikten sonra aktivite boyamasında ve SDS'li poliakrilamid jel elektroforezinde tek band vermiştir. SDS/PAGE'den alt bi rim molekül ağırlığı 52.500 dalton olduğu saptandı. Enzimin kinetik analizinden G-6P ve NADP+ için Km değerleri sırasıyla 130 (.ıM ve 1 1 J.M olarak bulundu. Kö pek karaciğeri G6PD'nm optimum pH'smın 7.7 olduğu gözlendi. Enzimin aktivas- yon entalpisi 8341 kal/mol ; aktivasyon enerjisi 8957 kal/mol ve sıcaklıkla aktivi te artma faktörünün de Q10 1.623 olduğu saptandı. G6PD'm diğer nükleotidler- den d-ANADP^yi, doğal koenzimi NADP+'ye oranla % 52 daha az kullandığı, NAD+'yi ise ihmal edilebilir düzeyde az kullandığı tespit edildi. G6PD'ın inhibitör- lerinden olan NADPH'm enzimi NADP+ ile kompetitif olarak inhibe ettiği ve inhi- bisyon sabitinin, Kj'nin 30 }iM olduğu bulundu. 63

SUMMARY G6PD from dog liver purified using 2', 5'-ADP Sepharose affinity column. The yield and specific activity of the purified enzyme were 18 percent and 130 units per miligram protein, respectively. Single band of G6PD activity staining on native pol- yacrylamide gel and SDS/PAGE electrophoresis were obtained with samples passed through 2', 5'-ADP- Sepharose column second time. Molecular weight of subunits were estimated as 52500 Da on SDS/PAGE. Km values of G6PD and NADP+ were to be 130 and 1 1 jiM, respectively. The optimum pH of dog liver G6PD was 7.7. Activation enthalpy and activation energy of enzyme were 8341 and 8957 cal/mol. The for dog liver G6PD Q10 was 1.623. The coenzyme analogue, d- ANADP+, used by G6PD with an efficiency of 52 per cent. It seems that NAD+ is not a coenzyme for dog liver G6PD. NADPH is a competetive inhibitor of G6PD with respect to NADP+ and the Ki obtained was 30 pM. 64