Enzim işaretleme tekniklerinin rutin analizlere uygulanımı

Abstract

ÖZET Bu çalışma, `progesteron-ll-Q&-hemisuksinat` m `Horse Radish Peroxidase` (HRP) a konjugasyomıyla ilgili işlevleri ve bu könjugatm kullanılmasıyla progesteron için basit bir katı-faz direkt (ekstraksiyon içermeyen) enzim immunoassay (EIA) yöntemi ni tarif etmektedir. 8-anilino-l-naftalen sülfonilik asit (ANS) bu yöntemde progesteronun bağlayıcı proteinlere bağlanmasını önleyen bir madde olarak yer almıştır. Anti progesteron antikor lar kaplanmış polipropilen tüpler progesteron-HRP ve standardlar- la (veya serum örnekleriyle) inkübe edildikten sonra serbest frak siyon bir kaç kez yıkama ile uzaklaştırıldı ve tüplerdeki HRP enziminin aktivitesij substrat olarak O-fenilendiamin (OPD) ve hidrojen peroksit kullanılarak tayin edildi. Elde edilen renkler shimadzu UV-240 spektrofotometresinde 492 nm dalga boyunda okun du. Oluşan renklerin şiddeti serbest progesteron miktarı ile ters ilişkili olarak değerlendirildi. Yöntemin duyarlılığı, özgüllü ğü, tekrarlanabilirliği ve doğruluğu konversiyonel RIA gibi olup elde edilen değerler RIA ile elde edilenlerle iyi bir korelasyon (r s 0.98) gösterdi. Sonuç olarak progesteron için geliştirilmiş ve ekstraksiyon basamağı içermeyen bu-kâtı-faz enzim immunoassay analitik ' geçer liliğe sahip olup radioimmunoassay için uygun bir alternatif oluşturmaktadır. -26-

SUMMARY This study describes a procedure for conjugation of proges- terone-lla-hemisusuccinate to `Horse Radish Peroxidase` (HRP) and a simple solid-phase enzyme immunoassay procedurs using progesterone HRP conjugate for progesterone in unextracted serum `direct` assay. 8-anilino-l-naphthalene sulfonic acid (ANS) is included to displace progesterone from binding proteins in serum. Anti-progesterone antibodies covalently coupled to poly- i propylene tubes were incubated with progesterone labellend-.HRP and standards or serum samples containin motive progesterone. After incubation free fraction was removed by several washings and the enzyme activity on the solid-phase was determined by reaction with O-phenylane diamine (OPD) and hydro j en peroxide (H_CO. The coloured reaction products formed were read off in shimadzü ;UV-240 spectrophotometer ( = '492), the intensity of the colour formation being inversely related to the concentration or native progesterone. The sensitivity, specificity, precision and accurancy of the method are similar to those of a convertional radioimmunoassay (RIA) for progesterone. Progesterone values obtained by this 1 procedurs agreed well (r = 0.98) with those obtained by radioim- { munoassay. We conclude that the solid-phase EIA for progesterone in unextracted serum developed by this study is analytically valid and offers a convenient alternative to RIA. -27-