Plazma serbest amino asitlerinin yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ve elekrokimyasal dedektör (HPLC-ECD) ile ölçümü

Abstract

Bu çalışmada hastanemiz koşullarında kesinliği, duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek olarak bilinen Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi - Elektrokimyasal Dedektör (HPLC-ECD) tekniğini kullanarak, plazma serbest amino asitlerinin miktar tayinini yapmayı amaçladık. Bu nedenle, alınan örnekleri, kolon ve sistem tarafından en etkin ve uygun şekilde ayrıştırıp, ve PITC (fenilizotiyosiyanat) ile türevlendirdik. Ters faz ayırım modunun kullanıldığı bu teknikte, tampon olarak asetat tampon (pH=6.4), çözücü olarak ise asetonitril (%60), gradiyent elüsyonu ile sisteme uygulandı. internal standart olarak norlösin, kolon olarak da C18 (ODS) kolonun kullanıldığı bu yöntemde, dedektörün akım duyarlılığı 10 pA, potansiyel değeri ise +1.1 V olarak ayarlandı. Önce, 17 amino asitin bulunduğu karışım halindeki standardlar, daha sonra da bilinmeyen örnekler ile çalışmalar, en uygun yöntem verileri elde edildi. Buna göre, her bir amino asidin ayrı ayrı piklerinin belli tutunma zamanlarında elde edildiği saptandı. Kromatogramda ilk pik olarak aspartik asit (RT=6.43 dakika), son pik olarak da lizine (RT=54.22 dakika) ait olan pikler alındı. Yaşa bağımlı amino asit düzeylerini saptamak amacıyla, doğum sırasında alınan kordon kanı ile birlikte, belirli yaş aralıklarındaki sağlıklı kontrol grubunda (n=85) miktar tayini yapılarak popülasyona ait referans değerler elde edilmeye çalışıldı. Buna göre, 1-4 yaş grubu çocuklarda, toplam serbest amino asit düzeyinin, diğer yaş gruplarına göre daha yüksek olduğu saptandı. Çalıştığımız yöntemin kesinliği, gün içi (%CV 7.30) ve günler arası (%CV 7.45) tekrarlanabilirlikle değerlendirildi. Amino asitlerin çoğu için, yöntemin 0.5- 1250 (iM konsantrasyona arasında lineer olduğu saptanırken, patolojik örnekler bu yöntemle çalışılarak doğrulandı. Bu arada normal ve patolojik idrar örnekleri ile de yöntem test edildi. Sonuç olarak, yöntemin, tekrarlanabilirliği olan, duyarlı, güvenilir ve rutin amaçlı kullanılabilecek bir yöntem olduğu kanısına varıldı.

In the present study, our aim was to assess and develop the method to determine the plasma free amino acid levels by using the High Pressure Liquid Chromatography - Electrochemical Detector (HPLC-ECD) known as the method with high precision, sensitivity and specificity. First, the sample was deproteinized by the ultrafiltration method and then the amino acids were derivatized with phenyl isothiocyanate (PITC) by which they were charged electrochemically and seperated efficiently by the C18 (ODS) column. In this assay, acetate buffer (pH=6.4) and acetonitrile (%60) as solvent were used in the gradient reversed - phase seperation mode. Detector values were 10jjA for current range and +1.1 V for potential applied. Norleucine was used as internal standart. The method was performed by studying the mixed standard of 17 amino acids. According to data, each peak of the individual amino acids was obtained in given retention times (RT). The first peak was for aspartic acid (RT=6.43 min) and the last one for lysine (RT=54.22 min) in the chromatogram. In the healthy individuals grouped according to the age ranges and cord blood (n=85), reference values were determined and it was found that total free amino acid level of the group aged between 1-4 is higher than the others'. Mean within-run and between-run precisions were determined to be 7.30% CV and 7.45% CV, respectively. Detection limit was found to be linear up to 1250 iM. The confirmation of the assay was done by running the patient samples by using this method. In addition, the healthy and patient urine samples were run to test the method. As a consequence, the method studied was assessed to be sensitive, reliable and reproducible enough for routine use and clinical application.