Prolidaz ve alkol dehidrogenaz ölçüm yöntemlerinin optimize edilmesi, hepatik fibrozinin tanı ve tedavisi ile olan ilişkilerinin araştırılması

Abstract

Farklı tiplerle oluşan, kronik karaciğer hastalıkları ilerleyerek, sıklıkla fibrozisle sonuçlanır. Hepatik fibrozis; bağ dokusu elemanlarının sentez ve yıkımı arasındaki dengenin bozulması ve disse aralığında, intertisyel kollajen birikimi ile karakterizedir.Fibrozis'in değerlendirilmesinde, karaciğer biopsisi temel alınmaktadır. İnvaziv olması, sık tekrarlanamaması,körlemesine alındı ğından tüm karaciğeri yansıtmada yetersiz kalması nedeniyle ideal bir test değildir. Diğer mevcut serum testlerinin de yetersiz özgüllüğe sahip olmala rından dolayı, hepatik fıbrozis'in; serum prolidaz, alkol dehidrojenaz (ADH) ve laktat düzeyleri ile değerlendirilmesi amaçlandı. Prolidaz, yeniden düzenlenen Chinard yöntemi ile spektrofotometrik olarak ölçüldü. Ayıraç olarak ;50mmol/l tris tampon(pH 8), 154mmol/l glisin-1- prolin,5mmol/l MnC12,,lmmol/l glutatyon(GSH),%0,l Triton-X100 ve yeniden düzenlenen Chinard ayıracı (550ml glasial asetikasit,450 mi 6mol/l ortofosforik asit,30gram ninhidrin) kullanıldı. ADH, çift ayıraçlı, rate yöntemi ile otoanalizöre uygulandı, ayıraçlar olarak; 100mmol/l glisin-NaOH(pH 9.6),50mmol/l etanol,2.7mmol/l NAD ve 10mmo/l tris kullanıldı. Çalışmamızda,ADH yöntemine, tris ilavesi ile ürün inhibisyonu ortadan kaldırıldı. Ayrıca çift ayıraçlı olarak uygulandı ve böylece serum körü alınması ve diğer dehidrojenaz aktivitelerinin inhibisyonu sağlandı. Yöntemin gün içi tekrarlanabilirliği 5 ve 30 U/L serum harmanları için sırası ile %2.04,%0.9, günler arası tekrarlanabilirliği % CV;%4.2 ve %2 dir. Prolidaz yönteminde;ön inkübasyon 3 saat olarak uygulanarak çalışma süresi kısaltıldı. Çözeltiye, GSH ve Triton-X 100 ilavesi, Chinard ayıracının yeniden düzenlenmesi ve serum körü çalışması ile çözeltinin stabilizasyonu ve yöntemin tekrarlanabilirliği artırıldı. Yöntemin gün içi tekrarlanabilirliği, (n=20) 720 vel400 U/L serum harmanlan için sırası ile %3.4 ve%2.06 günler arası tekrarlanabilirliği, %4.4 ve %2.9 olarak belirlendi.. Karaciğer biopsisi ile fibrozis tanısı konan 30 kronik aktif hepatitli hastada, interferon tedavisinden sonra, özellikle prolidaz olmak üzere, laktat ve ADH seviyeleri kontrol gurubuna göre anlamlı (P<0.05) olarak azalmış bulundu. Ayrıca kronik iyileşmeyen yaraları olan 35 hastanın,yara kenarlarından alınan deri biopsi parçalarında, hiper barik oksijen tedavisinden sonra prolidaz seviyeleri anlamlı (P<0.05) olarak azalmış bulundu. Elde edilen sonuçlar, özellikle prolidaz olmak üzere, ADH ve laktat seviyelerinin, hepatik fıbrozis'in değerlendirilmesinde, basit, ekonomik, invaziv olmayan ve sık tekrarlanabilir belirteçler olarak kullanılabileceğini gösterdi. 57

Different types of chronic disease of liver may progressively run to a common end point, termed fibrosis. Hepatic fibrosis impaired balance between synthesis and degradation of con- nective tissue components and is characterized with collagen deposition in Disse space. The evaluation of hepatic fibrosis is still based on liver biopsy, invazive, can not be repeated frequ- ently and blindly obtained may inadequately reflect the liver as a whole. Liver biopsy was not ideal test in asses ment of hepatic fibrosis. Since the serum methods which use to determine the hepatic fibrosis have the lack of specificity. The aim of the present study was to investigate the prolidase, ADH and lactat levels of serum in evaluation of hepatic fibrosis. Prolidase activity was measured spectrophotometrically our modified Chinard's metod. We used tris buffer 50mmol/L(pH 8),glycine-prolin 154mmol /l, MnC12 5mmol/l, glutathion (GSH) lmmol/1, 0.1% TritonX 100 and modified clinard's reagents (550 ml of glacial acetic acid, 450 ml of 6 mol/L orthophosphoric acid and 30 gr ninhydrin). ADH metod was adapted to the autoanalyzer with two-reagent rate chemistry parameters and sample blank we used; glycine NaOH buffer (pH9.6) 100 mmol/1, ethanol 50mmol/l,NAD 2.7mmol/l and trislO mmol/1. In our study, the use of tris in ADH method prevented the inhibition of product. Furthermore, in this method the use of two-reagents and the take of sample blank ensured the inhibition of the other dehidrogenase activities. Within run presicion of the ADH assay was2.04%,0.9% at 5 and 30 U/L in pooled sera, day to day presicion was4.2 % and 2%. The prolidase method, using the preincubation time of 3h reduced, the total analysis time. The addition GSH and triton XI 00 to reagent, the modification of chinard reagent, and the using of sample blank increased the stability and presicion of the method. Within run presicion prolidase assay was 3.4%, 2.6% at 720 and 1400 U/l in pooled sera, day to day presicion (% CV) was 4.4% and 2.9%. In 30 patients with chronic active hepatitis were diagnosed to have fibrosis after liver biopsy, lactat, ADH and especially prolidase levels significantly reduced after interferon therapy (P < 0.05). Prolidase activity in skin biopsies of wound area from 35 patients who have chronic refractory wound significantly reduced after hyperbaric oxygen therapy. In conclusion, our experimental data suggest that ADH, lactat levels and especially prolidase are useful marker with simple, economic, frequently repeatibily, non-invazive, in the evaluation of hepatic fibrosis. 58