Effects of centella asiatica saponins on telomerase activation and wound healing

Abstract

Centella asiatica L., dikkate değer biyolojik etkilere sahip olan, Güneydoğu Asya'ya özgü, iyi bilinen bir bitki türüdür. İçeriğin %80'inden fazlasını oluşturan triterpenik saponinlerin, biyolojik etkilerden sorumlu başlıca bileşikler olduğu öne sürülmektedir. Yakın zamanda yapılmış bir çalışmada, Centella asiatica ekstraktının telomeraz aktivasyonu sergilediği açıklanmıştır. Bu gelişmeler doğrultusunda, yaşlanma karşıtı özellikler gösteren doğal ürünler ile ilgili araştırmalarımızın bir parçası olarak Centella asiatica ve bileşenlerini çalışmaya karar verdik. Bu tez kapsamında, dört ana bileşik, madecassoside, asiaticoside, madecassic acid ve asiatic acid, standardize Centella asiatica ekstraktından izole edildi ve yapıları spektroskopik yöntemlerle aydınlatıldı. İn vitro yöntemler kullanılarak, ekstrakt ve saflaştırılmış bileşiklerin standart kültür ve oksidatif stres (H2O2) koşulları altındaki hücre proliferasyonuna, yara iyileşmesi ve insan Telomeraz Ters Transkriptaz (hTERT) protein seviyesi üzerine etkileri araştırıldı. Deneylerimiz, MRC-5 ve HEKn hücre hatları üzerinde gerçekleştirildi. Standartlaştırılmış Centella asiatica ekstraktının, MRC-5 hücrelerinin proliferasyonunu 5 ile 100 µg/ml konsantrasyon aralığında anlamlı bir şekilde arttırdığı gözlemlendi. Dahası, oksidatif stres koşulları altında, ekstrakt, 500 ve 1000 ng/ml konsantrasyonlarında MRC-5 hücreleri üzerinde koruyucu etkiler gösterdi. Madecassoside, madecassic acid, asiaticoside ve asiatic acid bileşikleri, MRC-5 hücreleri üzerine en yüksek proliferatif etkilerini sırasıyla, 1000 nM (%28), 2 nM (%66), 300 nM (%61) ve 300 nM (%56) konsantrasyonlarında sergilediler. Asiatic acid ve ekstrakt, MRC-5 hücrelerinde oluşturulan yara bölgelerinde, hücre göçünü 10 ile 300 nM veya ng/ml aralıklarında sırasıyla, %32 ve %36'ya kadar arttırdı. İmmünoblotlama çalışmaları, madecassoside ve asiaticoside bileşiklerinin, HEKn hücre hattındaki hTERT protein seviyesi ekspresyonunu 30 nM konsantrasyonlarında sırasıyla 3.16 ile 5.62 kat artırdığını gösterdi. Buna ek olarak, ekstrenin ise, 300 ng/ml konsantrasyonda protein seviyesini 2.62 kat arttırdığı tespit edildi.

Centella asiatica L. is a well-known plant species endemic to Southeast Asia that has noteworthy biological effects. Triterpenoid saponins, comprising more than 80% of the content, are suggested to be the chief compounds responsible for the biological effects. A recent study has described that the extract of Centella asiatica exhibits telomerase activation. In line with these developments, as part of our studies on natural products demonstrating anti-aging properties, we decided to engage Centella asiatica and its components. Within the scope of this thesis, four major compounds, viz. madecassoside, asiaticoside, madecassic acid, and asiatic acid were isolated from the standardized extract of Centella asiatica, and their structures were elucidated by spectroscopic methods. Using in vitro methods, the effects of the extract and purified compounds on cell proliferation under standard culture and oxidative stress (H2O2) conditions, wound healing, and human Telomerase Reverse Transcriptase (hTERT) protein level were investigated. Our experiments were conducted on MRC-5 and HEKn cell lines. It was observed that the standardized extract of Centella asiatica increased the proliferation of the MRC-5 cells meaningfully between 5 to 100 µg/ml. Moreover, the extract showed protective effects on MRC-5 cells at 500 and 1000 ng/ml under oxidative stress conditions. Madecassoside, madecassic acid, asiaticoside, and asiatic acid exhibited the highest proliferative effects on MRC-5 cells at concentrations of 1000 nM (28%), 2 nM (66%), 300 nM (61%), and 300 nM (56%), respectively. Asiatic acid and the extract accelerated cell migration in wound areas that were made on MRC-5 cells up to 32% and 36% in the range of 10 to 300 nM or ng/ml, respectively. The immunoblotting assay studies showed that madecassoside and asiaticoside were increased the expression of hTERT protein level on HEKn cell line by 3.16-fold and 5.62-fold, respectively, at 30 nM concentration. Furthermore, the extract was observed to increase the protein level by 2.62-fold at 300 ng/ml.